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DNA-Extraktion für den LAMP-Assay

DNA-Extraktion für den LAMP-Assay


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Ich versuche, einen LAMP-Assay (Loop-mediated isothermal Amplification) zum Nachweis von E.coli einzurichten.

Mir wurde gesagt, dass EDTA das Mg in meiner Reaktion chelatisieren kann und somit die Arbeit des Assays verhindert (ähnlich wie bei der PCR). Daher zögere ich, TE-Puffer zu verwenden. Kann ich meinen Primer-Mix vorbereiten und DNA (mit der Kochmethode) in DNAase-freiem Wasser extrahieren?

Beeinflusst das die Qualität meiner DNA und meiner Primer während der Lagerung?

Danke vielmals!

Alex


Obwohl dies theoretisch ein Problem ist, ist es in Wirklichkeit keins. Machen wir die Berechnung drum herum. EDTA komplexiert äquimolare Mengen zweiwertiger Kationen (z. B. Magnesium), sodass 1 mM EDTA 1 mM Magnesiumionen komplexiert. Nehmen wir an, die PCR-Reaktion enthält 2 mM Magnesium.

Eine typische PCR-Reaktion, die ich mache, hat ein Gesamtvolumen von 25 µl und enthält 1 µl DNA-Matrize in TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA). Die Endreaktion enthält 1/25 mM (oder 0,04 mM oder 40 nM) EDTA, das 0,04 mM Magnesium komplexieren kann. Anstatt die Reaktion mit 2 mM Magnesium durchzuführen, tun Sie es also mit 1,96 mM, was nicht auffällt.

Darüber hinaus summieren sich andere Fehler beim Einrichten (Pipetten nicht genau kalibriert, keine kleinen Mengen in die Flüssigkeit usw.) zu einem Gesamtfehler von 5-10%, was einen viel größeren Einfluss auf die Magnesiumkonzentration der Reaktion hat als das EDTA . Wenn Sie viel höhere Vorlagenkonzentrationen verwenden (was normalerweise nicht erforderlich ist), können Sie dies korrigieren, dies ist jedoch normalerweise nicht erforderlich.


Die herkömmliche Eiken LAMP-Formulierung weist einen Überschuss an Mg2+ auf. 5 µl TE mit 1 mM EDTA, die in eine 25-µl-Reaktion gehen, haben minimale Auswirkungen. Auf jeden Fall kann die LAMP-Formulierung in Mg2+ erhöht werden, um dies auszugleichen, aber ich bezweifle, dass dies überhaupt notwendig ist. Außerdem werden Insekten bei der Kochmethode mit vorhandenem EDTA besser lysiert und Nukleasen behindert.


Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP)

LAMP ist durch die Verwendung von 4 verschiedenen Primern gekennzeichnet, die speziell entwickelt wurden, um 6 verschiedene Regionen des Zielgens zu erkennen. Die vier verwendeten Primer sind wie folgt:

  1. Forward Inner Primer (FIP)
  2. Forward Outer Primer (FOP): Der FOP (auch F3-Primer genannt)
  3. Rückwärts innerer Primer (BIP)
  4. Rückwärts-Außenprimer (BOP)

Wenn das Zielgen (DNA-Template) und die Reagenzien bei einer konstanten Temperatur zwischen 60-65 °C inkubiert werden, laufen die folgenden Reaktionsschritte ab. Stufen der Schleifen-vermittelten isothermen Amplifikation Schritt 1 Einer der LAMP-Primer kann an die komplementäre Sequenz der doppelsträngigen Ziel-DNA anlagern und initiiert dann die DNA-Synthese unter Verwendung der DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität, wobei eine einzelsträngige DNA verdrängt und freigesetzt wird.

Bei der LAMP-Methode ist im Gegensatz zur PCR keine Hitzedenaturierung der doppelsträngigen DNA zu einem Einzelstrang erforderlich. Der folgende Amplifikationsmechanismus erklärt, ab wann das FIP an eine solche freigesetzte einzelsträngige Matrizen-DNA anlagert.


Einführung

Mehrere taxonomisch nicht verwandte Phytoplasmen aus mindestens 10 ribosomalen Untergruppen verursachen Weinrebenkrankheiten (GY) mit nahezu identischen Symptomen (Constable et al., 2003). Flavescence dorée (FD) ist die schwerste der GYs und ist derzeit in vielen Weinanbaugebieten Frankreichs und Italiens mit Ausbrüchen in Slowenien, Portugal und Serbien und einigen registrierten Vorkommen in Spanien, der Schweiz und Österreich weit verbreitet (EPPO, 2014 ). Der Erreger von FD ist ein Phytoplasma (FDp), das aufgrund von Sequenzähnlichkeiten der 16S rDNA zu den 16SrV-Untergruppen C und D gehört (Lee et al., 2004). FDp ist in der Richtlinie des Rates EU2000/29 über Schadorganismen und in der Quarantäneliste der EPPO A2 von Schädlingen und die Vernichtung von erkrankten Beständen, Pflanzen mit Symptomen und umgebenden Pflanzen sowie die Kontrolle ihres Vektors aufgeführt Scaphoideus titanus, ist obligatorisch. Daher wird dringend eine Methode zum schnellen Nachweis von FDp benötigt, um die Entscheidungsfindung zu beschleunigen und die Ausbreitung des Erregers entweder in Pflanzen, die im Handel oder im Freiland verlagert werden, zu begrenzen.

Der Nachweis von Phytoplasmen ist aufgrund ihrer ungleichmäßigen Verteilung innerhalb des Wirts und des niedrigen Titers, der von der Jahreszeit beeinflusst werden kann, schwierig. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass die FDp-Konzentration hoch genug sein kann, um mit einer geeigneten Technik (Prezelj et al., 2012). Weitere Probleme im Zusammenhang mit dem FDp-Nachweis sind ein aufwendiges DNA-Extraktionsverfahren (Abb. 1). Derzeit basiert der genaueste und zuverlässigste Nachweis von FDp auf verschiedenen molekularen Ansätzen. PCR-basierte Methoden, einschließlich Nested- und Multiplex-PCR, die entweder ribosomale oder nicht-ribosomale Phytoplasma-DNA amplifizieren (Daire et al., 1997 Claire et al., 2003), RFLP-Methoden unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme an diesen PCR-Produkten (Lee et al., 1998 Angelini et al., 2001 Marzachi et al., 2001 Martini et al., 2002 ) oder Sequenzierung, wurden entwickelt, um die Untergruppen von FDp zu unterscheiden. In jüngerer Zeit wurden quantitative Real-Time-PCR (qPCR)-basierte Assays für den FDp-spezifischen Nachweis entwickelt (Bianco et al., 2004 Hren et al., 2007 Mehle et al., 2013a). Obwohl die Sensitivität und Spezifität dieser diagnostischen Assays bei richtiger Anwendung ausreichend hoch sind, sind die Verfahren zeitaufwendig, erfordern teure Laborausrüstung und können aufgrund des Fehlens praktischer tragbarer Instrumente nicht im Feld durchgeführt werden.

Kürzlich wurde eine Loop-mediated isothermal-amplification (LAMP)-Methode (Notomi et al., 2000) entwickelt. Es umgeht die Echtzeit-PCR-Sensitivität gegenüber Inhibitoren (Francois et al., 2011 ) in Pflanzenextrakten (Boonham et al., 2004 ) und seine isotherme Natur bietet das Potenzial, im Feld eingesetzt zu werden (Tomlinson et al., 2010b). Aufgrund seiner Schnelligkeit, Robustheit und Einfachheit gewinnt der Einsatz von LAMP für die Diagnostik in der Humanmedizin (Parida et al., 2008 ) und neuerdings in der Pflanzengesundheit, einschließlich des Nachweises von Phytoplasmen (Tomlinson et al., 2010a Bekele et al., 2011 Hodgetts et al., 2011 ).

In dieser Arbeit wird über die Entwicklung eines Protokolls zum schnellen Nachweis von FDp in Weinreben unter Verwendung von LAMP berichtet, zusammen mit einer Technik zur Homogenisierung von Pflanzenmaterial vor Ort anstelle der DNA-Extraktion. Das gesamte Verfahren wurde nach den EPPO-Standards und den MIQE-Richtlinien (Bustin et al., 2010 ).


Entwicklung und Bewertung eines Loop-vermittelten isothermen Amplifikationsassays zum schnellen Nachweis und zur Identifizierung von Pektobakterium carotovorum auf Sellerie im Feld

Pektobakterium carotovorum ist der Erreger der bakteriellen Weichfäule in einer Vielzahl von pflanzlichen Wirtsarten. Wenn P. carotovorum die Pflanze infiziert, ist die Ausbreitung der Krankheit schwer zu kontrollieren. In dieser Studie wurde eine schnelle und sensitive Methode entwickelt, die auf der Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP) basiert, um P. carotovorum in Sellerie mit Weichfäule unter Verwendung eines Primer-Sets aus dem pmrA konservierte Folge von P. carotovorum. Die Spezifität des LAMP-Primer-Sets für P. carotovorum wurde auf beiden ausführlich validiert P. carotovorum Stämme und Nicht-Zielstämme. Die Empfindlichkeit betrug 1 pg P. carotovorum genomische DNA, die zehnmal empfindlicher war als der herkömmliche PCR-Assay. LAMP wurde auch verwendet, um zu erkennen P. carotovorum in Bakteriensuspension. Die niedrigste Nachweiskonzentration betrug 10 4 KBE · mL –1 . Darüber hinaus wurde ein LAMP-Assay in Verbindung mit einer Roh-DNA-Extraktionsmethode erfolgreich an P. carotovorum-infizierte Proben, die sowohl von künstlich als auch von natürlich infizierten Pflanzen stammen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der in dieser Studie etablierte LAMP-Assay eine einfache, sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von P. carotovorum, und hat eine potenzielle Anwendung bei der Bekämpfung der Sellerie-Weichfäule durch Früherkennung.


Schleifenvermittelte isotherme Verstärkung

Die Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) verwendet 4-6 Primer, die 6-8 verschiedene Regionen der Ziel-DNA für eine hochspezifische Amplifikationsreaktion erkennen. Eine strangverdrängende DNA-Polymerase initiiert die Synthese und 2 speziell entworfene Primer bilden „loop&rdquo-Strukturen, um nachfolgende Amplifikationsrunden durch Verlängerung an den Schleifen und zusätzliches Anlagern von Primern zu erleichtern. DNA-Produkte sind sehr lang (> 20 kb) und werden aus zahlreichen Wiederholungen der kurzen (80 &ndash 250 bp) Zielsequenz gebildet, die mit einzelsträngigen Schleifenregionen in langen Konkatameren verbunden sind. Diese Produkte sind typischerweise nicht für eine nachgeschaltete Manipulation geeignet, aber die Zielamplifikation ist so umfangreich, dass zahlreiche Nachweismethoden möglich sind. Echtzeit-Fluoreszenzdetektion mit Interkalatoren oder Sonden, Lateral Flow und Agarosegeldetektion sind alle direkt kompatibel mit LAMP-Reaktionen. Die Instrumentierung für LAMP erfordert typischerweise ein konsistentes Erhitzen auf die gewünschte Reaktionstemperatur und, wo erforderlich, Echtzeit-Fluoreszenz für quantitative Messungen. Optimierte Einstellungen für die Durchführung von LAMP-Experimenten auf isothermen Instrumenten finden Sie hier.

Reaktionstemperatur Amplikongröße Nachweismethode(n)
65°C <250 nt Visuell, Lateraler Fluss, Gel, Trübung

Die Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) verwendet 4-6 Primer, die 6-8 verschiedene Regionen der Ziel-DNA erkennen. Eine strangverdrängende DNA-Polymerase initiiert die Synthese und 2 der Primer bilden Schleifenstrukturen, um nachfolgende Amplifikationsrunden zu erleichtern.

Neben den traditionelleren oder komplexeren Nachweismethoden ist LAMP so produktiv, dass die Produkte und Nebenprodukte dieser Reaktionen auch mit dem Auge sichtbar gemacht werden können. Beispielsweise kann Magnesiumpyrophosphat, das während der Reaktion entsteht, als weißer Niederschlag beobachtet werden oder zugesetzte Indikatoren wie Calcein oder Hydroxynaphtholblau können verwendet werden, um eine positive Reaktion zu signalisieren. Alternativ ermöglicht die Verwendung des von NEB entwickelten 2X Colorimetric LAMP Master Mix eine starke Farbänderung von rosa nach gelb basierend auf einer pH-Änderung während der Reaktion. Eine aktualisierte Version dieses Produkts wurde mit dUTP und UDG formuliert, um mit der Vermeidung von Verschleppungen zwischen den Amplifikationsrunden und dem kolorimetrischen WarmStart LAMP 2X Master Mix mit UDG kompatibel zu sein. Die kolorimetrische Erkennungstechnologie ist eine Schlüsselkomponente des SARS-CoV-2 Rapid Colorimetric LAMP Assay Kit, das bei der Analyse von SARS-CoV-2, dem neuartigen Coronavirus, das COVID-19 verursacht, verwendet werden kann.

Das Entwerfen von LAMP-Primern kann eine Herausforderung sein, aber Softwaretools erleichtern diesen Prozess erheblich. Wir empfehlen die Verwendung des NEB LAMP Primer Design Tools zum Entwerfen von LAMP Primern. Nach Eingabe einer interessierenden DNA- oder RNA-Sequenz identifiziert das LAMP-Primer-Design-Tool geeignete Zielregionen und erstellt in einem einzigen Schritt die äußeren F3/B3- und Looping-inneren FIP/BIP-Primer. Die LoopF/LoopB-Primer, die die LAMP-Reaktion beschleunigen, werden in einem zweiten Schritt erstellt und werden für die beste Leistung dringend empfohlen.

LAMP eignet sich gut für die Point-of-Care- und Felddiagnostik und LAMP-Assays wurden für den Nachweis einer breiten Palette von RNA- und DNA-Zielen aus allen Arten von Proben entwickelt. Beispiele sind Tests für:

Die LAMP-Reaktion ist robust und tolerant gegenüber Inhibitoren, was auf Wunsch eine Rohprobenvorbereitung und eine minimale Nukleinsäurereinigung ermöglicht. WarmStart ® RTx und Bst 2.0 WarmStart wurden für eine optimale Leistung in LAMP/RT-LAMP entwickelt und werden in praktischen LAMP Master Mixes kombiniert, um das Assay-Design zu vereinfachen.


Abstrakt

Giardia duodenalis ist weltweit einer der häufigsten lebensmittel- und wasserübertragenen Darmparasiten von Mensch und Tier. Frische, verzehrfertige Produkte wie Blattgemüse und Salatmischungen gelten als potenzielle Übertragungsträger für Giardien Infektion beim Menschen. Daher ist eine spezifische, empfindliche und zuverlässige Methode für Giardien Erkennung in Blattgemüse ist erforderlich. Wir optimierten Waschverfahren zur Rückgewinnung von Giardien Zysten aus Blattgemüse und adaptierte und validierte einen bestehenden EF1α-LAMP-Assay zum Nachweis von Giardien DNA zur Unterstützung der routinemäßigen diagnostischen Überwachung und der Untersuchung von Krankheitsausbrüchen. Vier Blattgrünsorten (35 ± 1 g) wurden mit 100 Giardien Zysten und wir verglichen das Waschen durch Schütteln mit 1 M Glycin (n = 20) oder 0,1% Alconox (n = 20). DNA wurde aus Waschungen extrahiert, durch LAMP- und Schmelzkurvenanalyse getestet und die Zeit bis zum Positiven (TTP) verglichen. Die Nachweisgrenze wurde durch Aufstockung von 10 (n = 40) Giardien Zysten auf dieselben Blattgemüsesorten und Verarbeitung wie oben mit 0,1% Alconox. Die Robustheit der Methode wurde durch Unterziehen von Frühjahrsmischung (n = 45 insgesamt) bis zum Altern (1, 3 oder 7 Tage) und wird vor dem Testen unter Alterungs- und Gefrierbedingungen gewaschen. Die Reproduzierbarkeit und Spezifität des Assays wurden bewertet, und eine künstliche positive Kontrolle (APC), die durch die Schmelztemperatur (Tm) von DNA von Giardien gespickt auf Blattgemüse wurde entwickelt, um eine Kreuzkontamination durch die Kontrolle auszuschließen. Giardien Erkennungsraten waren höher und TTP war niedriger (P < 0,05) für 0,1% Alconox (19/20, 8,85 ± 0,3 min) verglichen mit 1 M Glycin (15/20, 14,53 ± 7,2 min). Der LAMP-Assay detektierte 10 Giardien Zysten auf Blattgemüse in 13–34 min in 14/40 getesteten Proben. Die Robustheitsbewertung zeigte, dass die TTP höher war (P < 0,0001), wenn mit Spikes versetztes Produkt 7 Tage (13,09 ± 1,14 min) gelagert wurde, verglichen mit frischem (9,72 ± 0,43 min). Keine ungespikten Proben waren LAMP-positiv, und die Tm für DNA von Giardien auf Blattgemüse gespickt war höher (P < 0,0001, 87,43 ± 0,05 °C) als der APC (86,43 ± 0,12 °C). Der Variationskoeffizient (VK) der Wiederholbarkeit innerhalb des Assays für TTP betrug 5,4%, und es trat keine Kreuzkontamination auf, wenn gespikte und nicht gespikte Proben in abwechselnder Reihenfolge verarbeitet wurden. Das optimierte Probenaufbereitungsverfahren in Kombination mit dem EF1α LAMP Assay ist eine sensitive, spezifische, arbeitssparende und schnelle Methode zum Nachweis von Giardien Zysten im Blattgemüse.


2.3 Herstellung von Raman-aktiven Au-Nanosonden

Au-Nanosonden bestehen aus Gold-Nanopartikeln, die mit Raman-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden funktionalisiert sind und wurden durch die folgenden Schritte synthetisiert. Citrat-bedeckte Gold-Nanopartikel wurden durch Natriumcitrat-basierte Reduktion von Chlorgoldsäure (HAuCl4)-Lösung, und dann mit 5'-thiolierten Oligonukleotiden modifiziert, die intern mit cy5 markiert sind. Kurz gesagt, wurden frisch reduzierte thiolierte Oligonukleotide (50 μ M) zu 1 ml Gold-Nanopartikel-Lösung gegeben und die Mischung wurde 12 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde dann auf 0,1 M NaCl gebracht und 40 h stehen gelassen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 12.000 ×g 30 min lang, um die Goldnanopartikel von den überschüssigen Reagenzien zu trennen [35]. Die isolierten Au-Nanosonden wurden schließlich zweimal mit 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) gewaschen und bei 4°C gelagert. Die präparierten Goldnanopartikel und Au-Nanosonden wurden mittels UV-Vis-Spektroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie und Raman-Spektroskopie charakterisiert.


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Loop-vermittelter isothermer Amplifikationsassay zum schnellen Nachweis häufiger Stämme von Escherichia coli. / Hill, Joshua Beriwal, Shilpa Chandra, Ishwad Paul, Vinod K. Kapil, Aarti Singh, Tripti Wadowsky, Robert M. Singh, Vinita Goyal, Ankur Jahnukainen, Timo Johnson, James R. Tarr, Phillip I. Vats, Abhay.

Forschungsergebnis : Beitrag zu Zeitschrift › Artikel › peer-review

T1 – Loop-vermittelter isothermer Amplifikationsassay zum schnellen Nachweis häufiger Stämme von Escherichia coli

N2 - Wir haben einen hochempfindlichen und spezifischen LAMP-Assay für Escherichia coli entwickelt. Es erfordert keine DNA-Extraktion und kann nur 10 Kopien nachweisen. Es entdeckte alle 36 von 36 E. coli-Isolaten und alle 22 Urinproben (von 89 getesteten Proben), die E. coli aufwiesen. Dieser Assay ist schnell, kostengünstig und einfach durchzuführen.

AB - Wir haben einen hochempfindlichen und spezifischen LAMP-Assay für Escherichia coli entwickelt. Es erfordert keine DNA-Extraktion und kann nur 10 Kopien nachweisen. Es entdeckte alle 36 von 36 E. coli-Isolaten und alle 22 Urinproben (von 89 getesteten Proben), die E. coli aufwiesen. Dieser Assay ist schnell, kostengünstig und einfach durchzuführen.


Methoden

Reagenzien und Geräte

Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper, Streptavidin und Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) monoklonaler IgG1-Antikörper, der für die Entwicklung von Nukleinsäure-Lateral-Flow-Immunoassays verwendet wurde oder allgemein als Lateral-Flow-Dipstick (LFD) bezeichnet wird, waren Produkte von Pierce Thermo Fisher Scientific (Massachusetts, USA). Die verwendete 40 nm kolloidale Goldlösung stammte von Kestrel Bio Sciences (Thailand), Western Blocking Reagens (WBR) stammte von Roche (Indianapolis, USA) und Rinderserumalbumin (BSA) wurde von Amresco (Solon, USA) bezogen. Betain, Mineralöl, Natriumazid (NaN3), Polyvinylalkohol (PVA), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Triton X-100, Tween-20, Saccharose und andere übliche Chemikalien stammten von Sigma (St. Louis, USA). Alle in dieser Studie verwendeten Chemikalien und Reagenzien wurden unter Verwendung von ultrareinem Wasser (>18 M&supmin;) aus einem Millipore Milli-Q-Wasserreinigungssystem (Billerica, USA) hergestellt. Unterdessen waren die Materialien, die für den Bau von LFD verwendet wurden, einschließlich Zellulosefaser-Pads, Glasfaser-Pads und Nitrozellulose-Membrankarte HF135, ebenfalls Produkte von Millipore.

Alle markierten und nicht markierten Oligonukleotide wurden von Integrated DNA Technologies (Singapur) synthetisiert. Rekombinant Taq Als Polymerase-Enzym für die konventionelle PCR und nPCR-Amplifikation wurde DNA-Polymerase (Thermo Fisher, USA) verwendet, und diese Reaktionen wurden mit dem Mastercycler Nexus Gradient Thermocycler (Eppendorf, Deutschland) durchgeführt. Währenddessen wurde qPCR mit dem QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Deutschland) und die Reaktion mit dem CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Kalifornien, USA) durchgeführt. Die Lampe Bst DNA-Polymerase wurde von New England Biolabs (Massachusetts, USA) bezogen und die Amplifikation wurde unter Verwendung eines Cole-Parmer-Kühlheizblocks (Illinois, USA) durchgeführt. Die konventionellen PCR-, nPCR- und LAMP-Amplikons wurden mit einem Agarosegel-Elektrophoresesystem (Owl Separation Systems, USA) analysiert und mit Alpha Innotech ChemiImager 5500 UV-Beleuchtung und Bilderfassungseinheit (Kalifornien, USA) visualisiert. Das LFD wurde manuell mit Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper und Streptavidin ausgekleidet und mit dem programmierbaren Streifenschneider Matrix 2360 von Kinematic Automation (Twain Harte, USA) in Streifen geschnitten. Der für die Post-LAMP-Analyse verwendete Calcein-Mangan-Farbstoff wurde unter Verwendung einer Kombination von Calcein-Indikator (Merck, USA) und Mangan(II)-Chlorid (MnCl&sub2;) hergestellt2) (Merck, USA).

Entamoeba Arten und andere Mikroorganismenstämme

Alle in dieser Studie verwendeten Mikroorganismenisolate sind in Tabelle 1 aufgeführt. Diese Isolate stammten vom Departamento de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexiko, der London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, UK, dem Department of Medizinische Mikrobiologie und Parasitologie, School of Medical Sciences, Universiti Sains Malaysia, Malaysia und Institute for Medical Research, Malaysia. E. histolytica HM-1:IMSS wurde lyophilisiert als positive Kontrolle verwendet E. ungleich SAW760 und E. moshkovskii Laredo wurden in dieser Studie als Negativkontrollen verwendet. DNA von E. histolytica wurde aus axenisch angebautem isoliert E. histolytica HM-1:IMSS während DNA von E. ungleich wurde aus lyophilisiertem . isoliert E. ungleich SAW760 mit Qiagen QIAamp DNA Stuhlextraktionskit (Deutschland). Beide Organismen wurden vom Departamento de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexiko, erhalten. Inzwischen DNA von E. moshkovskii Laredo wurde von der London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, UK, verliehen. DNA anderer Mikroorganismen wurde aus reiner Bakterienkultur unter Verwendung des NucleoSpin Tissue DNA Extraction Kit (MACHEREY-NAGEL GmbH &. Co. KG, Deutschland) isoliert. Diese DNAs wurden als Negativkontrollen zur Verifizierung der Spezifität konventioneller PCR-, nPCR-, qPCR- und LAMP-Primer verwendet.

Primer-Design

SREHP Gen wurde als Zielgen für den Nachweis von . ausgewählt E. histolytica in der vorliegenden Studie aufgrund ihrer hohen Spezifität sowohl in silico (BLAST-Suche) als auch empirischer Auswertung (PCR und LAMP-Amplifikation) im Vergleich zu anderen E. histolytica Gene. Alle in dieser Studie verwendeten Primer wurden basierend auf der konservierten Region des berichteten SREHP Gen (GenBank Zugangsnr. M80910.1, M34438.1, XM_643162.2, AB253474.1, AK420158.1, AK420282.1, AK420358.1, AK420741.1). Das für die LAMP-Anwendung verwendete Primer-Set wurde aus einer früheren Studie von Foo et al. [21] und die Position der Primer sind in 1 gezeigt. Eh-F3-SER- und Eh-B3-SER-Primer wurden als äußere Primer für die erste Runde der nPCR-Amplifikation verwendet, die ein Amplikon mit einer Größe von 223 bp erzeugen konnte. In der Zwischenzeit wurde das Primerpaar, das für die konventionelle PCR, die zweite Runde der nPCR und die qPCR-Amplifikation verwendet wurde, aus der F2-Region von Eh-FIP-SER als Vorwärtsprimer und der B2-Region von Eh-BIP-SER als Rückwärtsprimer angepasst, wodurch ein Amplikon mit der Größe 175 . erzeugt werden konnte bp. Die für die LAMP-Amplifikation verwendeten Primer, die mit LFD gekoppelt waren, insbesondere Eh-BIP-SER und Eh-LB-SER, wurden einer Modifikation unter Verwendung einer Hapten-Markierung am 5'-Ende der Oligonukleotidsequenz unterzogen. Fluorescein wurde am 5'-Ende von Eh-BIP-SER markiert, während Eh-LB-SER mit Biotin markiert wurde. Alle in dieser Studie verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Spezifität dieser Primer wurde empirisch unter Verwendung von DNA verifiziert, die aus . isoliert wurde E. histolytica, E. ungleich, E. moshkovskii Laredo und 75 andere Krankheitserreger, wie in Tabelle 1 gezeigt, bevor der Vergleich der analytischen Sensitivität zwischen den Assays durchgeführt wurde.

Primer-Regionen an SREHP Gensequenz (GenBank-Zugangsnr. M80910.1). Der Primer Eh-FIP-SER wird mit F1C und Eh-F2 gebildet, während der Primer Eh-BIP-SER mit B1C und Eh-B2 gebildet wird

Formulierung von LAMP, konventioneller PCR, nPCR und qPCR Assays

Das Verhältnis von äußerem Primer zu innerem Primer wurde optimiert und die Konzentration der Primer war optimal mit 2 μM von jedem Vorwärts-Innenprimer (Eh-FIP-SER) und Rückwärts-Innenprimer (Eh-BIP-SER), 0,167 μM von jedem Vorwärts-Außenprimer (Eh-F3-SER) und äußerer Rückwärtsprimer (Eh-B3-SER) und 0,333 &mgr;M Rückwärtsschleifenprimer (Eh-LB-SER). Die Konzentrationen von LAMP-Komponenten wie dNTPs-Mix, Betain, MgSO4 und Bst DNA-Polymerase wurden optimiert und empirisch bestimmt. Die Reaktion wurde mit einem Endvolumen von 30 µL Reaktionsansatz durchgeführt, der 1 × isothermer Amplifikationspuffer enthielt [20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % Tween 20] (New England Biolabs, Massachusetts, USA), 0,6 mM dNTP-Mix (Thermo Fisher Scientific, USA), 0,8 M Betain (Sigma, Missouri, USA), zusätzlich 6 mM MgSO4 (New England Biolabs, Massachusetts, USA), 16 U of Bst 2.0 WarmStart DNA-Polymerase (New England Biolabs, Massachusetts, USA) und 2 µL DNA-Template. Die Reaktion wurde 60 min bei 63 °C durchgeführt, gefolgt von einem Abbruch bei 80 °C für 5 min. Das LAMP-Produkt wurde einer Agarosegelelektrophorese, LFD und Calcein-Mangan-Farbstoff für die Post-LAMP-Analyse unterzogen.

Konventionelle PCR

Für die konventionelle PCR-Amplifikation wurden Eh-F2- und Eh-B2-Primer mit einer Konzentration von jeweils 1 µM verwendet. Die Amplifikation erfolgte in einem Endvolumen von 20 µL mit 1 × PCR-Puffer, 2,5 mM MgCl2 (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, USA), 0,16 mM dNTPs-Mix (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, USA), 1 U of Taq DNA-Polymerase (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, USA) und 2 µl DNA-Template. Die PCR-Reaktion wurde mit anfänglicher Denaturierung bei 95 °C für 5 min durchgeführt, gefolgt von 35 Zyklen bei 95 °C für 30 s, 56 °C für 30 s und 72 °C für 30 s und einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 Mindest. Das Produkt wurde einer Gelelektrophorese in 2% Agarosegel, gefärbt mit GelStain-Farbstoff (TransGen Biotech Co, Peking), unterzogen, elektrophoretisch unter 100 V für 60 Minuten laufen gelassen, gefolgt von einer Visualisierung unter Verwendung des ChemiImage 5000-Analysators.

Die erste PCR-Runde wurde mit Eh-F3-SER und Eh-B3-SER Primerpaar mit einer Konzentration von jeweils 1 µM durchgeführt. Die Amplifikation erfolgte in einem Endvolumen von 20 µL mit 1 × PCR-Puffer, 2,5 mM MgCl2 (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, USA), 0,16 mM dNTPs-Mix (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, USA), 1 U of Taq DNA-Polymerase (Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, USA) und 2 µL DNA-Template. Die PCR-Reaktion wurde mit anfänglicher Denaturierung bei 95 °C für 5 min durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen bei 95 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 30 s und einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 Mindest. Inzwischen wurde die zweite PCR-Runde mit Eh-F2- und Eh-B2-Primerpaar mit einer Konzentration von jeweils 1 µM durchgeführt. Die verwendete Reagenszusammensetzung war ähnlich wie bei der ersten PCR-Runde. Die Reaktion wurde mit anfänglicher Denaturierung bei 95 °C für 5 min, gefolgt von 35 Zyklen bei 95 °C für 30 s, 56 °C für 30 s und 72 °C für 30 s und einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 . durchgeführt Mindest. Das Produkt wurde einer Gelelektrophorese in 2% Agarosegel, gefärbt mit GelStain-Farbstoff, unterzogen, elektrophoretisch unter 100 V für 60 Minuten laufen gelassen und dann unter Verwendung des ChemiImage 5000-Analysators visualisiert.

Ähnlich wie bei konventioneller PCR und Zweitrundenreaktion der nPCR wurde die qPCR-Reaktion mit Eh-F2 und Eh-B2 Primerpaar mit einer Konzentration von jeweils 1 µM durchgeführt. Die Amplifikation erfolgte in einem Endvolumen von 25 µL mit 1 × QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix und 2 µL DNA-Template. Die Reaktion wurde mit der thermischen Zyklenbedingung der anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 5 min durchgeführt, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 20 s und 56 °C für 30 s. Die Schmelzkurvenanalyse wurde bei einem langsamen Anstieg von 65 °C auf 95 °C mit einer Geschwindigkeit von 0,5 °C pro 5 s durchgeführt. Der Baseline-Schwellenwert für die Post-Amplifikationsanalyse wurde auf 50 relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) festgelegt und jeder Quantifizierungszyklus (Cq)-Wert unter oder gleich 38 wird als positiv angesehen.

Vorbereitung der Post-LAMP-Analyse

Bau von LFD

In dieser Studie wurde Gold-Nanopartikel (GNP) als Signalgenerator für LFD verwendet. Die Biokonjugation von GNPs mit FITC IgG1 monoklonalem Antikörper und die Herstellung von LFD wurde wie von Foo et al. [21] mit einigen Modifikationen. Der LFD-Streifen mit einer Größe von 5 mm × 77 mm, bestehend aus Pufferauftragskissen, Goldkonjugatkissen, Nitrozellulosemembran und einem absorbierenden Kissen, wie in Abb. 2 gezeigt. Das LFD wurde mit 1 μg Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper als Chromatographie befestigt Kontrolllinie (CCL) und 2 µg Streptavidin als Testlinie (TL) gefolgt von Blockieren der unbeschichteten Nitrocelluloseoberfläche mit Blockierungspuffer [Gemisch aus 0,2% WBR, 0,05% Triton X-100 und 2 mM Phosphatpuffer (PB)]. Das Gold-Konjugat-Pad wurde mit funktionalisierter konjugierter GNP-Suspension [5 OD522 Goldkonjugat suspendiert in 2 mM PB, enthaltend 20 % (w/v) Saccharose, 0,01 % (v/v) PVA und 0,01 % (v/v) Tween-20] im Trockenreagenzformat, wie von Foo et al. [21].

Schematische Darstellung des Lateral Flow Peilstabstreifens

Herstellung von Calcein-Mangan-Farbstoff

Calcein-Mangan-Farbstoff wurde aus 500 μM Calcein hergestellt, das in Dimethylsulfoxid (Merck, USA) und 10 mM MnCl&sub2;2 die sich in nukleasefreiem Wasser gelöst hat. Für jede Reaktion wird nur 1 μL Calcein-Mangan-Farbstoff benötigt.

Prinzip von LFD

Das LFD wurde so formuliert, dass es sein doppelmarkiertes doppelsträngiges DNA-Amplikon durch die Bindung des am 5'-Ende des Amplikons markierten Biotins an das Streptavidin auf der Nitrozellulosemembran von LFD spezifisch erkennt. Die Testlinie erforderte amplifizierte doppelmarkierte doppelsträngige Amplikons als Verbindungsbrücke, um ein Signal zu erzeugen, das die Anwesenheit/Abwesenheit der Ziel-DNA darstellt. Die doppelmarkierten doppelsträngigen Amplikons (LAMP-Produkt) für TL wurden mit FAM am 5'-Ende markiert, das durch innere Primer synthetisiert wurde, während ein anderes 5'-Ende, das durch Schleifenprimer synthetisiert wurde, mit Biotin markiert wurde. Abb. 3. Streptavidin auf TL bildete Protein- Ligandenbindung mit Biotin auf doppelt markierten Amplikons. In der Zwischenzeit bildete CCL, das mit einem sekundären Anti-Maus-IgG-Antikörper aus der Ziege fixiert war, eine Protein-Ligand-Affinitätsbindung mit dem monoklonalen FITC-IgG1-Antikörper der Maus, der an Goldnanopartikel konjugiert war.

Schematische Darstellung der Bildung von doppelt markiertem Amplikon (LAMP-Produkt) als Analyt für den LFD-Nachweis

4 veranschaulicht ein schematisches Prinzip des LAMP-Produkts, das von Streptavidin auf einem Nachweispad von LFD eingefangen wird. An der Nachweisregion befestigtes Streptavidin immobilisierte die Amplikons durch Protein-Ligand-Bindung, die mit dem auf den Amplikons markierten Biotin gebildet wurde. Die doppelsträngigen Amplikons wurden durch die inneren LAMP-Primersequenzen und Loop-Primersequenzen gebildet. Daher wurde das andere 5'-Ende des Amplikons mit FAM präsentiert, das mit einem an Goldnanopartikel konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörper band. Das Vorhandensein einer rosaroten Linie in der Nachweisregion zeigte den Abschluss des Hybridisierungssandwichs zwischen den konjugierten GNPs, dem LAMP-Produkt und Streptavidin, was als positives Ergebnis interpretiert wurde.

Schematische Darstellung des Prinzips von LFD. Die Abbildung zeigt, dass das LAMP-Produkt durch Streptavidin auf der Membran immobilisiert wird, gefolgt von der Signalerzeugung durch konjugierte GNPs, die an Fluorescein binden

Post-LAMP-Analyse

Die Post-LAMP-Analyse wurde in 3 verschiedenen Techniken durchgeführt, nämlich Agarose-Gelelektrophorese, LFD und Calcein-Mangan-Farbstoff. Das LAMP-Produkt wurde einer Gelelektrophorese in 2,5% Agarosegel, gefärbt mit GelStain-Farbstoff, unterzogen, elektrophoretisch unter 100 V für 80 Minuten laufen gelassen, gefolgt von einer Visualisierung unter Verwendung des ChemiImage 5000-Analysators. Das Vorhandensein eines leiterartigen Bandenmusters auf dem Agarosegel zeigte eine positive Amplifikation an.

Der Nachweis von LAMP-Produkten mit LFD war ähnlich wie in einer früheren Studie [21]. Das amplifizierte Produkt mit einer Menge von 4 µL wurde mit 16 µL Laufpuffer [1 × PBS und 1% (v/v) Tween-20] gemischt und das Gemisch wurde auf den Nachweisbereich getropft. Das LFD wurde dann vertikal platziert, gefolgt vom Eintauchen des Pufferauftragskissens in 250 μl Laufpuffer. Das Ergebnis konnte mit bloßem Auge innerhalb von 10 bis 15 min auf der LFD-Nitrocellulosemembran visualisiert werden. Die Bildung einer roten gestrichelten Linie auf TL zeigte ein positives Ergebnis an, während das Fehlen von TL ein negatives Ergebnis anzeigte. CCL auf dem LFD diente als Verfahrens- und Betriebskontrolle für jede LAMP-Produktanalyse. Die Linienbildung auf CCL zeigte die Wirksamkeit des Signalgenerators an, die funktionalisierten GNPs, während das Fehlen von CCL ein falsch negatives Ergebnis anzeigte.

Die Analyse des LAMP-Produkts unter Verwendung von Calcein-Mangan-Farbstoff wurde durch Mischen von 1 &mgr;l Calcein-Mangan-Farbstoff in die 30 &mgr;l LAMP-Reagensmischung vor der Amplifikation durchgeführt. Mit Hilfe von UV-Licht wurde eine Röhre, die grün fluoreszierend wurde, als positiv angesehen, während eine negative Verstärkung als schwach grün blieb.

Analytische Spezifität der Assays

Die analytische Spezifität der Primer, die für die Anwendung von LAMP, konventioneller PCR, nPCR und qPCR verwendet wurden, wurde mit DNA bestimmt, die aus E. histolytica, E. ungleich, E. moshkovskii Laredo und 75 weitere Krankheitserreger, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Um eine umfassende Untersuchung der Spezifität zu gewährleisten, wurde diese Studie getrennt für LAMP, konventionelle PCR, nPCR und qPCR durchgeführt.

Bewertung der Assay-Leistung

Alle 4 Amplifikationsassays wurden in dieser Studie optimiert. Die Leistung der Assays wurde anhand ihrer analytischen Sensitivität in Bezug auf den LoD unter Verwendung von 10-fach verdünntem . bewertet E. histolytica Trophozoiten. The diluted trophozoites in a range of 10 6 to 10 − 4 trophozoites were spiked into 200 mg of stool samples and left for 1 h at ambient temperature prior to DNA isolation. Extracted DNAs from the spiked stool samples in a range of 10 6 to 10 − 3 trophozoites were used for PCR while LoD for LAMP amplification was determined using trophozoites range up to 10 − 4 . All the evaluation tests were performed in triplicate.


Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of sesame phyllody phytoplasmas in Vietnam

Phloem-limiting phytoplasmas are known to be causal agents of phyllody, which is recognized by the abnormal development of floral structures resulting in serious yield losses in sesame plants. Currently, identification of the various groups of phytoplasmas that cause sesame phyllody (SP) is conducted by nested PCR, RFLP, and multiplex real-time qPCR assays. However, these methods require intensive labor and are costly and time-consuming so can only be undertaken in well-equipped labs. Here, diagnostic loop-mediated isothermal amplification (LAMP)–based assays allowing rapid detection of specific groups of phytoplasmas within 30 min were developed based on detection of the 16S rRNA sequence of phytoplasmas. Universal 16S rRNA phytoplasma primers and seven primer sets of different 16Sr group phytoplasmas (16SrI, 16SrII, 16SrIII, 16SrIV, 16SrV, 16SrX, 16SrXI) and universal plant cytochrome oxidase (cox) gene primers were used to detect 16S rRNA group phytoplasma sequences and the cox gene in sesame plants. The LAMP assays were carried out using a real-time fluorometer with amplification plots and annealing curves visualized directly. Results demonstrated that the 16SrI and 16SrII group phytoplasmas were causal agents of sesame phyllody in Vietnam. LAMP-based assays for in-field detection of sesame phyllody-causing phytoplasmas revealed advantages and potential applicability in comparison with conventional approaches. To the best of our knowledge, this is the first assessment of multiple phytoplasma infection associated with sesame phyllody disease in Vietnam using LAMP-based assays.

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