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Welche Mechanismen gibt es für die Exzision bestimmter Sequenzen aus der DNA?

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Ich kenne Rekombinasen (insbesondere Exzisasen) bereits, habe mich aber gefragt, ob es noch andere Mechanismen gibt.


Genome Editing-Techniken wie CRISPR-Cas und TALEN verwenden unspezifische Rekombinasen, die an einen DNA-erkennenden Teil gekoppelt sind, der so gestaltet werden kann, dass er für jeden Sequenzabschnitt spezifisch ist, da er aus einzelnen Zinkfinger-„Modulen“ aufgebaut ist, die jeweils spezifisch sind binden ein paar Nukleotide (je ein Nukleotid bei TALEN).


Mechanismen der DNA-Transposition

DNA-Transposasen verwenden ein begrenztes Repertoire an strukturell und mechanistisch unterschiedlichen Nukleasedomänen, um die DNA-Strangbruch- und Wiedervereinigungsreaktionen zu katalysieren, die die DNA-Transposition umfassen. Hier besprechen wir die Mechanismen der vier bekannten Arten von Transpositionsreaktionen, die durch (1) RNase H-ähnliche Transposasen (auch bekannt als DD(E/D)-Enzyme) (2) einzelsträngige HUH-DNA-Transposasen (3) Serin-Transposasen katalysiert werden und (4) Tyrosintransposasen. Die große Menge akkumulierter biochemischer und struktureller Daten, insbesondere für die RNase H-ähnlichen Transposasen, hat nicht nur die charakteristischen Merkmale jeder Transposonfamilie, sondern auch einige aufkommende Themen offenbart, die in allen Familien konserviert erscheinen. Die in jüngerer Zeit charakterisierten einzelsträngigen DNA-Transposasen geben Aufschluss darüber, wie eine alte HUH-Domänenfaltung für die Transposition angepasst wurde, um eine Exzision und dann eine ortsspezifische Integration zu erreichen. Die Serin- und Tyrosin-Transposasen sind strukturell und mechanistisch mit ihren Cousins, den ortsspezifischen Serin- und Tyrosin-Rekombinasen, verwandt, wurden aber bisher weniger intensiv untersucht. Diese Arten von Enzymen sind besonders faszinierend, da sie im Zusammenhang mit der ortsspezifischen Rekombination eine strikte Homologie zwischen den Rekombinationsstellen erfordern, aber für die Transposition kann die Verbindung von Transposonenden zu einem ausgeschnittenen Kreis und dann die Integration in eine genomische Stelle mit stark entspannter Sequenz katalysiert werden Spezifität.

Figuren

Grundlegende chemische Reaktionen, katalysiert durch…

Grundlegende chemische Reaktionen, die durch DNA-Transposasen katalysiert werden. (EIN) Ein RNase H-ähnliches aktives Zentrum,…

Vorgeschlagener Weg für den Transposon-Kreis…

Vorgeschlagener Weg für die Transposon-Kreis-Integration in die Ziel-DNA, katalysiert durch ein Serin…

Weg der konjugativen Transposition. Ob…

Weg der konjugativen Transposition. Ob katalysiert durch eine Serin- oder eine Tyrosin-Transposase,…

Vorgeschlagene Wege der Exzision und…

Vorgeschlagene Wege der Exzision und Integration durch Tyrosintransposasen. (EIN) Transposon-Exzision. (B)…

Transpositionswege für RNase H-ähnliche…

Transpositionswege für RNase H-ähnliche Transposasen. Pfeile zeigen Stellen der Strangspaltung und…

Transpososomenstrukturen für die RNase…

Transpososomenstrukturen für die RNase H-ähnlichen DNA-Transposasen. Karikaturdarstellungen von fünf Transpososomen…

Transpososom der HUH-Transposase…

Transpososom der HUH-Transposase TnpA von IS 608 , als Bindung modelliert…


Genome Editing von Algenarten durch CRISPR Cas9 für Biokraftstoffe

15.3.4.1 Vektorbasierter Ausdruck

Cas9 und die Guide-RNA können entweder einzeln in getrennten Vektoren oder zusammen in einem einzigen Vektor kloniert und unter die Kontrolle von Promotoren und Terminatoren gestellt werden. Um eine ausreichende Expression von Cas9 sicherzustellen, kann ein konstitutiver Promotor verwendet werden. Die konstitutive Expression von Cas9 ist jedoch für bestimmte Algen toxisch (Jiang et al., 2014). Die Verwendung induzierbarer Promotoren ist eine praktikable Lösung für das Cas9-Toxizitätsproblem (Verruto et al., 2018). Ebenso wurden episomale Expressionsvektoren verwendet, um das Problem der variablen Cas9-Expression zu lösen und ein markerloses Editierwerkzeug bereitzustellen, da die Episomen aus den Zellen verloren gehen, wenn der Selektionsdruck entfernt wird (Poliner et al., 2018 Slattery et al., 2018).


Schritte in der DNA-Replikation

Der Prozess der DNA-Replikation ist komplex und umfasst eine Reihe von Proteinen und Enzymen, die kollektiv Nukleotide in der vorbestimmten Sequenz zusammenbauen. Als Reaktion auf die molekularen Signale, die während der Zellteilung empfangen werden, initiieren diese Moleküle die DNA-Replikation und synthetisieren zwei neue Stränge unter Verwendung der vorhandenen Stränge als Matrizen. Jedes der beiden resultierenden identischen DNA-Moleküle besteht aus einem alten und einem neuen DNA-Strang. Daher wird der Prozess der DNA-Replikation als halbkonservativ bezeichnet.

Die Reihe von Ereignissen, die während der prokaryotischen DNA-Replikation auftreten, wurde unten erklärt.

Einleitung

Die DNA-Replikation beginnt an einer bestimmten Stelle, die als Replikationsursprung bezeichnet wird und eine spezifische Sequenz aufweist, die von Initiatorproteinen namens DnaA erkannt werden kann. Sie binden an den Ursprungsstellen an das DNA-Molekül und markieren es so für das Andocken anderer Proteine ​​und Enzyme, die für die DNA-Replikation essentiell sind. Ein Enzym namens Helicase wird an der Stelle rekrutiert, um die Helices in Einzelstränge aufzuwickeln.

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Helicasen brechen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Basenpaaren energieabhängig auf. Dieser Punkt oder diese Region der DNA ist heute als bekannt Replikationsgabel. Sobald die Helices abgewickelt sind, binden Proteine, die als einzelsträngige Bindungsproteine ​​(SSB) bezeichnet werden, an die abgewickelten Regionen und verhindern, dass sie aneinanderlagern. Dadurch wird der Replikationsvorgang eingeleitet und die Replikationsgabeln verlaufen in zwei entgegengesetzte Richtungen entlang des DNA-Moleküls.

Primer-Synthese

Die Synthese eines neuen, komplementären DNA-Strangs unter Verwendung des bestehenden Strangs als Matrize erfolgt durch Enzyme, die als DNA-Polymerasen bekannt sind. Neben der Replikation spielen sie auch eine wichtige Rolle bei der DNA-Reparatur und -Rekombination.

DNA-Polymerasen können jedoch die DNA-Synthese nicht unabhängig starten und benötigen eine 3′ Hydroxylgruppe, um die Addition komplementärer Nukleotide zu starten. Dies wird durch ein Enzym namens DNA-Primase bereitgestellt, das eine Art DNA-abhängiger RNA-Polymerase ist. Es synthetisiert einen kurzen Abschnitt der RNA auf die vorhandenen DNA-Stränge. Dieses kurze Segment wird Primer genannt und umfasst 9-12 Nukleotide. Dies gibt der DNA-Polymerase die erforderliche Plattform, um mit dem Kopieren eines DNA-Strangs zu beginnen. Sobald die Primer auf beiden Strängen gebildet sind, können DNA-Polymerasen diese Primer zu neuen DNA-Strängen verlängern.

Das Abwickeln der DNA kann in den der Gabelung folgenden Regionen Supercoiling verursachen. Diese DNA-Supercoils werden durch ein spezielles Enzym namens Topoisomerase entspannt, das vor der Replikationsgabel an die DNA-Strecke bindet. Es erzeugt eine Kerbe im DNA-Strang, um die Superspirale zu entlasten.

Führende Strangsynthese

DNA-Polymerasen können neue Nukleotide nur an das 3′ Ende eines bestehenden Strangs hinzufügen und können daher DNA nur in 5′ → 3′ Richtung synthetisieren. Da die DNA-Stränge jedoch in entgegengesetzte Richtungen verlaufen, kann die DNA-Synthese an einem Strang kontinuierlich erfolgen. Dies wird als führender Strang bezeichnet.

Hier erkennt DNA-Polymerase III (DNA pol III) das 3′ OH-Ende des RNA-Primers und fügt neue komplementäre Nukleotide hinzu. Während die Replikationsgabel fortschreitet, werden kontinuierlich neue Nukleotide hinzugefügt, wodurch der neue Strang erzeugt wird.

Synthese von verzögerten Strängen

Auf dem gegenüberliegenden Strang wird die DNA diskontinuierlich synthetisiert, indem eine Reihe kleiner Fragmente neuer DNA in der Richtung 5′ → 3′ erzeugt wird. Diese Fragmente werden Okazaki-Fragmente genannt, die später zu einer kontinuierlichen Nukleotidkette verbunden werden. Dieser Strang wird als der nacheilende Strang bezeichnet, da der Prozess der DNA-Synthese auf diesem Strang mit einer geringeren Geschwindigkeit abläuft.

Hier fügt die Primase an mehreren Stellen entlang des abgewickelten Strangs Primer hinzu. DNA pol III verlängert den Primer durch Hinzufügen neuer Nukleotide und fällt ab, wenn es auf das zuvor gebildete Fragment trifft. Daher muss es den DNA-Strang freisetzen und weiter stromaufwärts gleiten, um die Verlängerung eines anderen RNA-Primers zu starten. Eine verschiebbare Klammer hält die DNA an ihrem Platz, während sie sich durch den Replikationsprozess bewegt.

Primer-Entfernung

Obwohl neue DNA-Stränge synthetisiert wurden, müssen die auf den neu gebildeten Strängen vorhandenen RNA-Primer durch DNA ersetzt werden. Diese Aktivität wird durch das Enzym DNA-Polymerase I (DNA pol I) ausgeführt. Es entfernt spezifisch die RNA-Primer über seine 5′ → 3′ Exonuklease-Aktivität und ersetzt sie durch neue Desoxyribonukleotide durch die 5′ → 3′ DNA-Polymerase-Aktivität.

Ligatur

Nachdem die Primerentfernung abgeschlossen ist, enthält der nacheilende Strang immer noch Lücken oder Kerben zwischen den benachbarten Okazaki-Fragmenten. Das Enzym Ligase identifiziert und versiegelt diese Kerben, indem es eine Phosphodiesterbindung zwischen den 5′ Phosphat- und 3′ Hydroxylgruppen benachbarter Fragmente herstellt.

Beendigung

Diese Replikationsmaschinerie stoppt an spezifischen Terminationsstellen, die eine einzigartige Nukleotidsequenz umfassen. Diese Sequenz wird durch spezialisierte Proteine ​​namens tus identifiziert, die an diese Stellen binden und so den Weg der Helikase physisch blockieren. Wenn die Helikase auf das Tus-Protein trifft, fällt sie zusammen mit den nahegelegenen einzelsträngigen Bindungsproteinen ab.

Faktendatei

Der DNA-Replikationsprozess ist mit Hilfe der 3′ → 5′ Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerasen nahezu fehlerfrei. DNA pol III liest die Nukleotide, die dem Strang neu hinzugefügt werden, Korrektur. Wenn ein Nukleotid falsch hinzugefügt wurde, erkennt DNA pol III den Fehler sofort, entfernt die falsche Base, fügt das richtige Nukleotid hinzu und fährt dann fort.

Unterschied zwischen prokaryotischer und eukaryotischer DNA-Replikation

Obwohl der grundlegende Mechanismus derselbe bleibt, ist die eukaryotische DNA-Replikation viel komplexer und umfasst eine größere Anzahl von Proteinen und Enzymen. Auch die regulatorischen Mechanismen für die DNA-Replikation sind weiter entwickelt und komplizierter.

  • Bei Prokaryoten ist die DNA-Replikation der erste Schritt der Zellteilung. Auf der anderen Seite wird die eukaryotische DNA-Replikation von den Zellzyklusregulatoren kompliziert gesteuert, und der Prozess findet während der ‘S’ oder Synthesephase des Zellzyklus statt.
  • Im Gegensatz zu prokaryontischer DNA liegt die eukaryontische DNA immer in Kombination mit Histonproteinen vor, die an der Regulation der Genexpression beteiligt sind. Während der Replikation müssen diese Proteine ​​kurz vor dem Abwickeln der DNA entfernt werden.
  • Aufgrund der höheren genomischen Größe und Komplexität von Eukaryoten sind entlang der DNA mehrere Ursprungs- und Terminationsstellen für die Replikation vorhanden. Die Region zwischen einem Satz von Ursprungs- und Terminationsstellen wird als Replikationseinheit oder Replikon bezeichnet, in der ein Replikationsereignis stattfindet. Dies ermöglicht eine schnellere und genauere DNA-Replikation im Vergleich zum prokaryontischen System mit einem einzelnen Replikon.
  • Die in Prokaryoten gebildeten Okazaki-Fragmente sind im Vergleich zu denen in Eukaryoten länger. In Escherichia coli (E. coli) sind sie etwa 1000 bis 2000 Nukleotide lang, während ihre Länge bei Eukaryoten zwischen 100 und 200 Nukleotiden liegt.
  • Ein weiterer interessanter Unterschied bei der prokaryotischen und eukaryotischen DNA-Replikation liegt im Terminationsschritt der Replikation. Bei Prokaryoten treffen sich die beiden Replikationsgabeln, die sich entlang des ringförmigen DNA-Moleküls in entgegengesetzte Richtungen bewegen, an der Terminationsstelle und die Replikation stoppt. Da eukaryotische DNA jedoch ein lineares Molekül ist, ist der nacheilende Strang kürzer als der Matrizenstrang. Um den Verlust genetischer Informationen durch eine solche Verkürzung zu vermeiden, weisen Chromosomenenden eine Reihe von sich wiederholenden Sequenzen auf, die als Telomere bezeichnet werden und nichtkodierende DNA umfassen.

Faktendatei

Die menschliche DNA wird mit etwa 50 Basenpaaren pro Sekunde kopiert. Aufgrund der Initiierung der Replikation an mehreren Standorten ist der Vorgang innerhalb einer Stunde abgeschlossen. Wenn dies nicht der Fall wäre, würde es ungefähr einen Monat dauern, bis die Replikation eines einzelnen Chromosoms abgeschlossen ist!

Die Gene eines Organismus enthalten alle notwendigen Informationen, um das richtige Molekül in der richtigen Menge und zum richtigen Zeitpunkt zu synthetisieren. Die Replikation ist der Weg, um sicherzustellen, dass diese codierten Informationen an jede Zelle des Körpers und auch an die nachfolgenden Generationen weitergegeben werden. Immerhin, wie Richard Dawkins zu Recht betont:

“Sie sind die Replikatoren und wir ihre Überlebensmaschinen. Wenn wir unseren Zweck erfüllt haben, werden wir beiseite geworfen. Aber Gene sind Bewohner der geologischen Zeit: Gene sind für immer.”

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2 Beteiligung von Genen an der Generierung genetischer Variationen

Genetische Variation ist eine Voraussetzung für die biologische Evolution. Tatsächlich sind gemischte Populationen von Elternformen und verschiedenen genetischen Varianten das Substrat für die natürliche Selektion, die durch die Lebensbedingungen der Organismen ausgeübt wird. Es ist immer noch eine weit verbreitete Meinung, dass genetische Varianten spontan aus Fehlern und Fehlern bei der Replikation oder Unfällen der DNA resultieren, die zu Veränderungen der Basensequenz führen. Mit einer ähnlichen Einstellung werden mobile genetische Elemente oft als egoistisch oder parasitär angesehen, und seltene, nicht reproduzierbare Rekombinationsereignisse werden als illegitim bezeichnet. In den folgenden Überlegungen vertrete ich eine andere Auffassung, die ich bereits seit einigen Jahren propagiere [ 3–6].

Die hier zu verteidigende These postuliert die Existenz von Evolutionsgenen, deren Produkte der biologischen Evolution der Organismenpopulation zugute kommen. Nach dieser Hypothese gibt es prinzipiell zwei Arten von Evolutionsgenen. Die Produkte des einen Gentyps sind Erzeuger genetischer Variationen, während die Produkte des anderen Gentyps Modulatoren der Häufigkeit genetischer Variationen sind. Evolutionsgene beeinflussen daher im Allgemeinen die Art und die Häufigkeit genetischer Variation, die in einer Population von Organismen auftritt, und können manchmal ein gewisses Maß an genetischer Isolierung gewährleisten.

Bakterien müssen sich auf unserem Planeten seit etwa 3,8 Milliarden Jahren entwickelt haben. Die derzeit gefundene Vielfalt bakterieller Lebensformen beeindruckt vor allem hinsichtlich ihrer unterschiedlichen Lebensfähigkeit unter extremen Umweltbedingungen wie chemischer Zusammensetzung, pH-Wert, Temperatur und Druck. Darüber hinaus sind viele Bakterienarten zu Symbionten oder Krankheitserregern geworden und haben sich an das Leben in enger Gemeinschaft mit anderen Organismen angepasst. Handelt es sich bei letzteren um höhere Organismen, muss die evolutionäre Anpassung der heutigen pathogenen Bakterien erst vor relativ kurzer Zeit stattgefunden haben. Wir können daher erwarten, in heutigen Bakterien gute Beispiele für Evolutionsgene zu finden. Tatsächlich ist es wahrscheinlich, dass Evolutionsgene selbst eine lange Evolution durchlaufen haben und nun auf ihre gegenwärtigen Funktionen abgestimmt sind.

Die Theorie der molekularen Evolution postuliert, dass die Produkte der Evolutionsgene Hand in Hand mit anderen Faktoren wie Struktur- und Stabilitätsmerkmalen biologischer Makromoleküle, der Wirkung chemischer und physikalischer Mutagene sowie der Möglichkeit zufälliger Begegnungen interaktiver Komponenten zusammenwirken.

Eine zusammenfassende Darstellung genetischer und nicht-genetischer Elemente, von denen die Theorie der molekularen Evolution postuliert, dass sie zur spontanen Erzeugung genetischer Varianten beitragen, ist in Abb. 1 gegeben.

Evolutionsgene und nicht-genetische Faktoren tragen zur Erzeugung genetischer Variationen bei.


Mechanismus der DNA-vermittelten Transposition

Einige Familien transponierbarer Elemente, die sich über ein DNA-Zwischenprodukt bewegen, tun dies auf replikative Weise. In diesem Fall erzeugt die Transposition eine neue Kopie des transponierbaren Elements an der Ziel-Site, während eine Kopie an der ursprünglichen Site zurückbleibt. Durch Fusion der Donor- und Empfänger-Replikons entsteht eine kointegrierte Struktur, die dann aufgelöst wird (Abb. 9.12). Andere Familien verwenden einen nicht-replizierenden Mechanismus. In diesem Fall wird die Originalkopie von der Original-Site ausgeschnitten und auf eine neue Ziel-Site verschoben, wobei die Original-Site frei bleibt.

Abbildung 9.12: Kontraste zwischen replikativer und nicht-replikativer Transposition. Das transponierbare Element (TE) ist als offener Pfeil dargestellt. Die dicke Linie für jedes Replikon repräsentiert doppelsträngige DNA, die unterschiedlichen Schattierungen repräsentieren unterschiedliche Sequenzen.

Studien an bakteriellen Transposons haben gezeigt, dass die replikative Transposition und einige Arten der nicht-replikativen Transposition über ein Strangtransfer-Intermediat (auch als Crossover-Struktur bekannt) verlaufen, bei dem sowohl das Donor- als auch das Empfänger-Replikon an das transponierbare Element angelagert sind (Abbildung 9.13). Für die replikative Transposition erzeugt die DNA-Synthese durch das Strangtransfer-Zwischenprodukt ein transponierbares Element sowohl an der Donor- als auch an der Zielstelle, wodurch das kointegrierte Zwischenprodukt gebildet wird. Dies wird anschließend aufgelöst, um die Replikons zu trennen. Die DNA-Synthese findet bei der nicht-replikativen Transposition an der Crossover-Struktur nicht statt, so dass eine Kopie nur an der neuen Zielstelle zurückbleibt. Bei einem alternativen Weg für die nicht-replikative Transposition wird das Transposon durch zwei Doppelstrangbrüche herausgeschnitten und an einem gestaffelten Bruch mit dem Empfänger verbunden (in Abbildung 9.12 unten dargestellt).

Genauer gesagt gibt es zwei gemeinsame Schritte für die replikative und nicht-replikative Transposition, die das Strangtransfer-Intermediat erzeugen (Abbildung 9.13).

  1. Die von einem transponierbaren Element kodierte Transposase macht anfangs vier Nicks. An der Zielstelle werden zwei Kerben gemacht, einer in jedem Strang, um einen gestaffelten Bruch mit 5'-Verlängerungen (3' zurückgesetzt) ​​zu erzeugen. Die anderen beiden Nicks flankieren das Transposon, ein Nick wird in einem DNA-Strang an einem Ende des Transposons gemacht, und der andere Nick wird in dem anderen DNA-Strang am anderen Ende gemacht. Da das Transposon an jedem Ende invertierte Wiederholungen aufweist, sind diese beiden Kerben, die das Transposon flankieren, Spaltungen in der gleichen Sequenz. Somit weist die Transposase eine sequenzspezifische Nicking-Aktivität auf. Zum Beispiel bindet die Transposase von TnA an eine Sequenz von etwa 25 bp, die sich innerhalb der 38 bp des invertierten terminalen Repeats befindet (Abbildung 9.10). Es schneidet einen Einzelstrang an jedem Ende des Transposons sowie an der Zielstelle (Abbildung 9.13). Beachten Sie, dass Target und Transposon in der zweidimensionalen Zeichnung in Abbildung 9.13 zwar getrennt dargestellt sind, sie jedoch während der Transposition nebeneinander liegen.
  2. An jedem Ende des Transposons ist das 3'-Ende eines Strangs des Transposons mit der 5'-Verlängerung eines Strangs an der Zielstelle verbunden. Diese Ligation wird auch durch Transposase katalysiert. ATP stimuliert die Reaktion, kann aber auch in Abwesenheit von ATP auftreten, wenn das Substrat supercoiled ist. Die Ligation der Enden des Transposons an die Zielstelle erzeugt ein Strangtransfer-Zwischenprodukt, bei dem nun die Donor- und Empfänger-Replicons durch das Transposon verbunden werden.

Nach der Bildung des Strangtransfer-Intermediats können zwei verschiedene Wege verfolgt werden. Bei der replikativen Transposition dienen die 3'-Enden jedes Strangs des gestaffelten Bruchs (ursprünglich an der Zielstelle) als Primer für die Reparatursynthese (Abbildung 9.13). Die Replikation gefolgt von der Ligation führt zur Bildung der kointegrierten Struktur, die dann in die einzelnen Replikons mit jeweils einer Kopie des Transposons aufgelöst werden kann. Die vom Transposon TnA kodierte Resolvase katalysiert die Auflösung der kointegrierten Struktur. Die Auflösungsstelle (res) liegt zwischen den divergent transkribierten Genen für tnpA und tnpR (Abbildung 9.10). Die TnA-Resolvase reguliert auch die Expression von sowohl tnpA als auch tnpR (selbst) negativ.

Bei nicht-replikativer Transposition wird das Strangtransfer-Zwischenprodukt durch Nicken an den anfänglich nicht geknickten Enden des Transposons freigesetzt. Die Reparatursynthese ist auf die Lücke an den flankierenden direkten Wiederholungen beschränkt, und daher verbleibt nur eine Kopie des Transposons. Diese Kopie wird an die neue Zielstelle ligiert, wobei eine freie Stelle im Donormolekül zurückbleibt.

Abbildung 9.13. Mechanismus der Transposition über ein Strangtransferintermediat.

Das Enzym Transposase kann spezifische DNA-Sequenzen erkennen, zwei Duplex-DNA-Moleküle an vier Stellen spalten und Stränge vom Spender zum Empfänger ligieren. Dieses Enzym besitzt eine bemerkenswerte Fähigkeit, die Enden der DNA zu erzeugen und zu manipulieren. Eine dreidimensionale Struktur für die Tn5-Transposase im Komplex mit den Enden der Tn5-DNA wurde von Rayment und Kollegen gelöst. Eine statische Ansicht dieses Protein-DNA-Komplexes ist in Abbildung 9.14.A. Die Transposase ist ein Dimer, und jedes doppelsträngige DNA-Molekül (Donor und Target) wird von beiden Proteinuntereinheiten gebunden. Dadurch werden die Transposonenden in die aktiven Zentren orientiert, wie in der Abbildung gezeigt. Auch ein Bild mit nur der DNA (Abbildung 9.14.B.) zeigt eine erhebliche Verzerrung der DNA-Helix an den Enden. Diese kürzlich ermittelte Struktur ist ein guter Ausgangspunkt, um den Mechanismus der Strangspaltung und -übertragung besser zu verstehen.

Abbildung 9.14. Dreidimensionale Struktur der Tn5-Transposase im Komplex mit Tn5-Transposon-DNA. A. Das Dimer der Tn5-Transposase ist an ein Fragment der Duplex-DNA vom Ende des Transposons gebunden gezeigt. Alpha-Helices sind grüne Zylinder, Beta-Sheets sind gelb-braun, flache Pfeile und Protein-Schleifen sind blaue Drähte. Die DNA ist ein Duplex aus zwei roten Drähten, einer für jeden Strang. B. Die DNA wird ohne Protein und mit markierten Nukleotiden gezeigt. Das Ende der DNA oben in diesem Panel ist in das aktive Zentrum in der Mitte des Proteins in Panel A orientiert. Die Struktur wurde von Davies DR, Goryshin IY, Reznikoff WS, Rayment I. (2000) &ldquoThree-dimensional . bestimmt Struktur des Transpositionsintermediats des synaptischen Tn5-Komplexes.&rdquo Science 289:77-85. Diese Bilder wurden erhalten, indem die Atomkoordinaten aus der Molecular Modeling Database des NCBI heruntergeladen, mit CN3D 3.0 angezeigt und statische Ansichten als Screenshots gespeichert wurden. Die Datei zum Betrachten eines virtuellen dreidimensionalen Bildes ist auf der Studiengangswebsite verfügbar.

Transponierbare Elemente, die sich über RNA-Zwischenstufen bewegen

Transponierbare DNA-Sequenzen, die sich über ein RNA-Zwischenprodukt bewegen, werden als . bezeichnet Retrotransposons. Sie kommen in eukaryontischen Organismen sehr häufig vor, einige Beispiele wurden jedoch auch in Bakterien gefunden. Einige Retrotransposons haben lange terminale Wiederholungen (LTRs), die die Expression regulieren (Abbildung 9.15). Die LTRs wurden ursprünglich in Retroviren entdeckt. Sie wurden jetzt in einigen, aber nicht allen Retrotransposons gesehen. Sie haben einen starken Promotor und Enhancer sowie Signale für die Bildung des 3&rsquo-Endes von mRNAs nach der Transkription. Das Vorhandensein des LTR ist für diese Familie charakteristisch, und Mitglieder werden als LTR-enthaltende Retrotransposons bezeichnet. Beispiele sind die Hefe Ty-1Familie und retrovirale Proviren bei Wirbeltieren. Retrovirale Proviren kodieren eine reverse Transkriptase und eine Endonuklease sowie andere Proteine, von denen einige für den viralen Zusammenbau und die Struktur benötigt werden.

Andere Retrotransposons gehören zur großen und vielfältigen Klasse der Nicht-LTR-Retrotransposons (Abbildung 9.15). Eines der am weitesten verbreiteten Beispiele ist die Familie der long indurchsetzt sich wiederholend eElemente oder LINEs. Es wurde ursprünglich bei Säugetieren gefunden, wurde aber jetzt in einer Vielzahl von Stämmen, einschließlich Pilzen, gefunden. Die erste und häufigste LINE-Familie bei Säugetieren ist die LINE1-Familie, auch L1 genannt. Eine ältere Familie, die jedoch später entdeckt wurde, heißt LINE2. LINEs voller Länge sind etwa 7000 bp lang, und beim Menschen gibt es etwa 10.000 Kopien. Viele andere Kopien werden von den 5&rsquo-Enden abgeschnitten. Wie retrovirale Proviren kodiert das Volllängen-L1 eine reverse Transkriptase und eine Endonuklease sowie andere Proteine. Der Promoter ist jedoch kein LTR. Andere häufig vorkommende Nicht-LTR-Retrotransposons, die ursprünglich bei Säugetieren entdeckt wurden, sind Short indurchsetzt sich wiederholend eElemente oder SINEs. Diese sind etwa 300 bp lang. AluWiederholungen mit über einer Million Kopien bilden die vorherrschende Klasse von SINEs beim Menschen. Nicht-LTR-Retrotransposons neben LINEs werden in vielen anderen Spezies gefunden, wie z Jockey wiederholt sich in Drosophila.

Abbildung 9.15. Vier Klassen transponierbarer Elemente machen die überwiegende Mehrheit der menschlichen repetitiven DNA aus. Aus dem Nature-Papier &ldquoInitial Sequencing and Analysis of the Human Genome&rdquo des International Human Genome Consortium.

Umfangreiche Studien an genomischen DNA-Sequenzen haben die Rekonstruktion der Geschichte der transponierbaren Elemente bei Menschen und anderen Säugetieren ermöglicht. Der Hauptansatz bestand darin, die verschiedenen Arten von Wiederholungen (selbst transponierbare Elemente) zu klassifizieren, die Sequenzen auszurichten und zu bestimmen, wie unterschiedlich die Mitglieder einer Familie voneinander sind. Da die überwiegende Mehrheit der Wiederholungen bei der Transposition nicht mehr aktiv ist und keine andere offensichtliche Funktion hat, werden sie Mutationen schnell und mit neutraler Geschwindigkeit akkumulieren. Somit ist die Sequenz der neueren transponierenden Elemente der Quellsequenz ähnlicher als die Elemente, die früher transponiert wurden. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigen, dass sich die verschiedenen Wiederholungsfamilien im Laufe der Evolution in unterschiedlichen Wellen ausgebreitet haben (Abbildung 9.16). Die LINE2-Elemente waren vor der Divergenz der Säugetiere vor etwa 100 Millionen Jahren reichlich vorhanden. Sowohl LINE1 als auch Alu Wiederholungen haben sich in jüngerer Zeit beim Menschen vermehrt. Es ist wahrscheinlich, dass die LINE1-Elemente, die für eine Nuklease und eine reverse Transkriptase kodieren, Funktionen bereitstellen, die für die Transposition und Expansion von . benötigt werden Alu wiederholt. LINE1-Elemente haben sich in allen Ordnungen von Säugetieren ausgedehnt, aber jede Ordnung hat ein charakteristisches SINE, die alle von einem Gen abgeleitet sind, das von RNA-Polymerase III transkribiert wurde. Dies hat zu der Idee geführt, dass LINE1-Elemente Funktionen bereitstellen, die andere unterschiedliche Transkriptionseinheiten für die Transposition verwenden.

Abbildung 9.16. Altersverteilung von Wiederholungen bei Mensch und Maus. Die LINE2- und MIR-Wiederholungen vermehrten sich vor der Bestrahlung von Säugetieren vor etwa 100 Millionen Jahren, aber Alu-Wiederholungen werden durch kürzliche Transpositionen bei Primaten gebildet (hellblauer Teil der Balkendiagramme in einund B). Die LINE1- und LTR-Wiederholungen werden mit ungefähr der gleichen Frequenz transponiert wie in der Vergangenheit in der Maus-Linie (Panels C und D), aber nur wenige Wiederholungen werden noch in Human transponiert (Panels ein und B). Aus dem Nature-Papier &ldquoInitial Sequencing and Analysis of the Human Genome&rdquo des International Human Genome Consortium.


Epigenetik: Ein Problem für die Evolution?

Bis zu diesen Erkenntnissen lehnten viele Evolutionisten die Ideen von Charles Darwins Zeitgenosse Jean-Baptiste Lamarck ab, der glaubte, dass Tiere durch Interaktionen mit ihrer Umwelt neue Eigenschaften erwerben und sie dann an die nächste Generation weitergeben könnten. Zum Beispiel glaubte er, dass Giraffen, die in einer Generation ihre Hälse strecken, um Blätter an Bäumen zu erreichen, dazu führen würden, dass Giraffen in der nächsten Generation längere Hälse haben. Viele wissenschaftliche Lehrbücher lehnen heute Lamarcks Ideen ab, aber die Epigenetik ist eine Form des Lamarckianismus.

Dies steht natürlich im Gegensatz zur klassischen Darwinschen Evolution. Die Evolutionstheorie basiert auf zufälligen Veränderungen oder Mutationen in der DNA. Wenn eine Veränderung von Vorteil ist, wird der Organismus durch die natürliche Selektion überleben und diese Eigenschaft an seine Nachkommen weitergeben.

Obwohl Evolutionisten die Realität der Epigenetik nicht leugnen, ist ihre Existenz schwer zu erklären! Epigenetische Veränderungen sind nicht zufällig, sie treten als Reaktion auf die Umwelt über komplexe Mechanismen auf, die bereits vorhanden sind, um diese Veränderungen zu fördern.

Diese nicht zufälligen epigenetischen Veränderungen implizieren, dass die Evolution einen „Verstand“ hat. Kreaturen scheinen über komplexe Mechanismen zu verfügen, um epigenetische Veränderungen vorzunehmen, die es ihnen ermöglichen, sich an . anzupassen Zukunft Umweltherausforderungen. Aber woher kommt dieses zukunftsweisende Design? Die Evolution ist sinnlos, sie kann die Zukunft nicht sehen. Wie könnte es also Mechanismen entwickeln, um sich auf die Zukunft vorzubereiten?

Aber Gott tut es! Gott ist allwissend (allwissend) und er wusste im Voraus, dass Adam und Eva sündigen würden. Er würde diese Sünde richten (Genesis 3) und die Welt würde verflucht sein (Römer 8,22). Gott wusste, dass Organismen die Fähigkeit brauchen würden, sich in einer Welt anzupassen, die nicht mehr „sehr gut“ war. Gott hat wahrscheinlich Organismen mit epigenetischen Mechanismen entworfen, die es ihnen ermöglichen, sich leicht und schnell in Bezug auf ihre Umgebung zu verändern. Diese Arten von Veränderungen sind viel wertvoller als zufällige Mutationen und natürliche Selektion, da sie unmittelbare Vorteile für die Nachkommen haben können, ohne die grundlegenden Informationen in der tatsächlichen DNA-Sequenz zu beeinträchtigen.

Obwohl wir oft hören, dass „nichts in der Biologie Sinn macht außer im Licht der Evolution“, sollte gesagt werden, dass „nichts in der Biologie ohne den Schöpfergott Sinn macht“. Epigenetik ist ein spannendes Wissenschaftsgebiet, das die Intelligenz und Vorsehung Gottes zeigt, um Organismen zu helfen, sich in einer gefallenen Welt anzupassen und zu überleben.


Forschung

Auf der fundamentalen Ebene ist das Leben eine Ansammlung von Zellen, die biochemische Reaktionen beherbergen, und biochemische Reaktionen wiederum sind eine Ansammlung interagierender Biomoleküle, die einer strukturellen und chemischen Dynamik unterliegen. Heute verfügen wir nicht über die experimentellen Mittel, um biochemische Reaktionen mit atomarer Auflösung zu visualisieren. Dies hat unsere Fähigkeit eingeschränkt, ein wirklich prädiktives Verständnis der elementaren Prozesse aufzubauen, die lebende Zellen steuern und letztendlich zu Krankheiten führen. Daher verstehen wir weder vollständig, welche Faktoren die Mutationswahrscheinlichkeit während der DNA-Replikation im Reagenzglas bestimmen, noch sind wir in der Lage, Mutations-Hotspots vorherzusagen, die zu Krankheiten wie Krebs führen. In ähnlicher Weise können wir aus den ersten Prinzipien nicht vorhersagen, ob ein Medikament an ein bestimmtes biomolekulares Ziel in einem Reagenzglas bindet oder nicht oder ob es ein wirksames Therapeutikum in Zellen und in vivo sein wird. Ziel des Al-Hashimi-Labors ist es, neue Methoden zur „Abbildung“ der Dynamik von Nukleinsäuren in atomarer Auflösung zu entwickeln und mit diesem Wissen die Waage vom Reagenzglas über die Zelle bis zum Organismus zu überbrücken. Einige unserer übergreifenden Ziele umfassen das quantitative Verständnis der Mechanismen, die zu genomischer Instabilität führen, wie sich RNA auf atomarer Ebene zu 3D-Strukturen faltet, und die Entwicklung von RNA und DNA, die auf niedermolekulare Therapeutika abzielen, um Krankheiten von AIDS bis Krebs zu bekämpfen.

Entwicklung von Methoden zur Bestimmung dynamischer Nukleinsäure-Ensembles mit atomarer Auflösung: Rolle bei der molekularen Erkennung und RNA-Faltung

Während es heute trivial ist, die zelluläre Dynamik, wie die Zellteilung, mit einem Mikroskop physikalisch zu sehen, gibt es noch keine Technologie, um die strukturelle oder chemische Dynamik biochemischer Reaktionen auf atomarer Ebene zu visualisieren, selbst für die einfachsten Moleküle. Wir entwickeln hybride experimentell-rechnerische Methoden, die dieses Ziel erreichen und dynamische Nukleinsäure-Ensembles mit atomarer Auflösung bestimmen. Unsere bisherigen Bemühungen haben zur ersten experimentellen 3D-Visualisierung von Bewegungen in RNA mit atomarer Auflösung geführt. Wir verbessern weiterhin die Ansätze zur Ensemblebestimmung sowie den Aufbau von Rahmenwerken für die Nutzung dieser dynamischen Ensemblebeschreibungen, um die Mechanismen der adaptiven RNA-Erkennungssequenz-spezifischen DNA-Proteinerkennung und der RNA-Tertiärfaltung aufzuklären. Collaborators on these projects include Terry Oas (Duke) Dan Herschlag (Stanford) and Rick Russell (University of Texas-Austin). See this Movie of an unbound HIV-1 RNA dynamically sampling its many different drug-bound conformations.

  • Zhang Q, Sun X, Watt EW, and Al-Hashimi HM (2006). Resolving the Motional Modes that Code for RNA Adaptation. Wissenschaft 311: 653-6
  • Zhang Q, Stelzer AC, Fisher CK, and Al-Hashimi HM (2007). Visualizing Spatially Correlated Dynamics that Directs RNA Conformational Transitions. Natur 450:1263-7
  • Bailor M, Sun X, and Al-Hashimi HM Topology Links RNA Secondary Structure with Global Conformation Dynamics and Adaptation Wissenschaft 327(5962):202-6 2010

Fleeting conformational states of nucleic acids: Role in spontaneous mutations RNA tertiary folding and in the mechanisms of epitranscriptomics

In biology, some of the most functionally important conformational states of biomolecules exist in exceptionally low abundance (<0.01%) last for as little as a millionth of a second and can involve subtle sub-angstrom movements of atoms. Our group has advanced approaches that combine NMR spectroscopic techniques with chemical traps for capturing such fleeting states in nucleic acids. This led to the discovery of rare nucleic acid conformational states that are implicated the mechanisms of spontaneous mutations translational errors viral replication and RNA tertiary folding. We are examining the function of these fleeting states as well as their potential as opportune drug targets by using mutations to knock out or trap these states in in vitro and cell-based experiments. We are also investigating how epitranscriptomic modifications may exert their biological function by modulating the dynamics to these fleeting conformational states. Collaborators on these projects include Stacy Horner Bryan Cullen Chris Holly and Terry Oas at Duke. See this Movie for an example of fleeting base pair states that are thought to underlie spontaneous mutations.

  • Xue Y, Gracia B, Herschlag D, Russell R, and Al-Hashimi HM (2016) Visualizing Formation of an RNA Folding Intermediate through a Fast Highly Modular Secondary Structure Switch Naturkommunikation
  • Kimsey I, Petzold K, Sathyamoorthy B, Stein Z, and Al-Hashimi HM (2015). Visualizing Transient Watson-Crick Like Mispairs in DNA and RNA Duplexes. Natur 519(7543):315-20
  • Dethoff L, Petzold K, Chugh J, Casiano-Negroni A, and Al-Hashimi HM (2012). Visualizing Transient Low-Populated Structures of RNA. Natur 491(7426):724-8

Hoogsteen Base Pairs: Redefining the DNA Double helix

Our group made the discovery that in canonical DNA duplexes, Watson-Crick base pairs exist in dynamic equilibrium with Hoogsteen base pairs in which the guanine or adenine base flips

180 degrees to form a unique set of hydrogen bonds with its cytosine or thymine base complement. We are developing and applying methods based on solid state NMR and infrared (IR) spectroscopy to resolve Watson-Crick and Hoogsteen base pairs and their dynamic equilibria in nucleosomes and chromatin. We are examining the role of Hoogsteen base pairs in exposing the Watson-Crick face of nucleotide bases to mutagenic damage. We are also developing a new sequencing approach (‘Hoog-seq’) to map Hoogsteen base pairs genome-wide in vivo. We are interested in examining the enrichment of Hoogsteen base pairs relative to nucleosome positioning and other genomic features to assess potentially broader roles for Hoogsteen base pairs in gene expression and genome stability. Collaborators on these projects include the Jane and David Richardson, Kate Meyer, and David MacAlphine (Duke), Ioan Andricioaei (UC-Irvine), and Christopher Jaroniec (OSU). See this Movie to see the transitions between Watson-Crick and Hoogsteen base pairs.

  • Alvey HS, Gottardo FL, Nikolova EN, Al-Hashimi HM Widespread Transient Hoogsteen Base-Pairs in Canonical Duplex DNA with Variable Energetics Naturkommunikation5:4786 2014
  • Nikolova E, Kim E, Wise A, O’Brien P, Andricioaei I, and Al-Hashimi HM (2011). Transient Hoogsteen Base-pairs in Canonical Duplex DNA. Natur 470(7335):498-502

RNA and DNA-targeted drug discovery

We are developing a dynamic-ensemble based virtual screening platform for enabling the rational discovery of nucleic acid targeting small molecule therapeutics. Our effort has so far focused on targeting functionally important non-coding RNA in HIV-1 as well as on the development of anti-cancer therapies targeting duplex DNA. By computationally docking a dynamic ensemble of RNA structures determined using our NMR-based methods, rather than a single static structure, we have overcome a major obstacle in structure-based RNA-targeted drug discovery. Docking to an HIV-1 RNA target ensemble resulted in the first computational discovery of an RNA-targeting small molecule with in vivo activity. We are also extending these approaches to target rare and unusual conformational states of nucleic acids that exist in low abundance (<1%) and for short periods of time (lifetimes on the order of milliseconds). These projects marry NMR spectroscopic, computational, in vitro and cell-based studies. Collaborators on these projects include Bryan Cullen and Amanda Hargrove (Duke). See this Movie for example of RNA ensemble used in computational docking.


In July of each year, the Journal devotes an entire online issue to web-based software resources of value to the biological community. For an article to be considered, authors must upload a one-page summary at https://nar.bihealth.de/ to check the suitability of their proposed submission by 20 December at the latest. Special Web Server issue submission instructions. Papers appear online only but print copies of the Web Server issue are available for purchase.

The editors periodically review emerging scientific areas where the journal would like to attract more submissions. Currently these include:

Nucleic acid therapeutics

Nucleic acid therapeutics have been the subject of research and development for more than thirty years. Recently, momentum in the field has increased as advances in basic science and applied science have led to promising results in clinical trials. NAR welcomes submissions in all areas related to the development of nucleic acid therapeutics. Reports must include rigorous controls and statistical analysis. Advanced in mechanistic understanding should be stressed. Studies describing clinical results will be considered, but only if studies address key questions related to drug mechanism of action, distribution, or pharmacokinetics. Studies relating to cellular uptake, delivery, and oligonucleotide chemistry are particularly encouraged.

Functional roles of RNA modification

Traditionally, studies of the mechanisms and consequences of base modification focused mainly on stable RNAs including tRNAs, rRNAs and snRNAs. These have gained importance in recent years through advances in understanding the roles of modified bases in translational decoding and pre-mRNA splicing, for example. In parallel, the development of more sensitive detection tools and the application of genome-wide approaches has paved the way for studies aimed at understanding the impact of base modification on the structure, function, and subcellular localization of mRNAs as well as both small and large noncoding RNAs. The journal welcomes submissions that describe experimental studies aimed at understanding the mechanisms through which RNA modification enzymes (“writer” proteins) select their target sites and downstream “reader” proteins recognize modified RNA molecules. Studies that report the results of sequencing RNA populations carrying a particular modification are acceptable only if they include follow-up experiments that provide mechanistic insight into the physiological or functional relevance of the modification.

Single cell gene regulation studies

While cell population based gene expression studies have proven invaluable in dissecting transcriptional networks, it is becoming increasingly recognised that single cell studies more accurately reflect the molecular events involved, particularly when investigating transcriptional dynamics. We therefore encourage studies that measure single cell gene expression, using emerging (high throughput) technologies including sequencing, systems fluorescence/luminescence-based microscopy approaches and PCR-based methodologies.

Nuclear architecture and functional consequences

We welcome submissions describing experimental and theoretical studies that address the manner in which the architectural organization of genomes and RNomes determines and regulates biological function. Reciprocally, studies that uncover the mechanisms governing the establishment, maintenance and dynamic rearrangements of nuclear and nucleoprotein architectures or the impact of these architectures on processes such as genome stability, DNA repair, transcription, or RNA processing, transport, translation and degradation are welcome.

We welcome submissions that describe new methods (computational and experimental) to address these questions on a cellular scale. Entirely computational studies that investigate or integrate information from published datasets should provide significant new biological insights into the phenomenon investigated.

Gene targeting and genome engineering

The journal encourages manuscripts that report novel approaches for the targeted insertion, disruption or modification of individual sites within biological genomes. Such papers might present completely novel strategies to engineer gene targeting scaffolds, or novel combinations or fusions of these scaffolds with functional or catalytic domains that enhance or alter their functions. Studies correlating the activity of such systems in living cells to clearly measured genetic outcomes (recombination, end-joining, mutagenesis, off-target activities) are also encouraged. We particularly welcome papers that describe novel strategies and applications to drive ex vivo or in vivo genome modifications in primary (patient-derived) cells and tissues for therapeutic purpose.

Papers describing extension of existing gene targeting approaches to alternative cell lines or additional model organisms are discouraged unless the underlying biological question being studied is highly significant, novel and directly relevant to nucleic acid biology or chemistry.

Molecular machines and complex molecular assemblages

Studies that elucidate novel features of the composition, structure or mechanism of molecular machines and higher order assemblages involved in nucleic acid biology are strongly encouraged. Topics of interest, which may be investigated using experimental and/or computational methods, include the manners in which molecular machines and systems are organized and dynamically remodeled. Of particular interest are studies that employ high resolution CryoEM visualization of molecular machines and assemblages to address important mechanistic questions of function.

We welcome submissions that describe new methods (computational and experimental) to address these questions. Studies that investigate or integrate information from published datasets will be considered only if the underlying biological question being studied is highly significant, novel and directly relevant to nucleic acid biology or chemistry. Such studies should provide significant new biological insights into the phenomenon investigated.

Single molecule studies of macromolecular function

Studies that use single molecule methods (optical and magnetic tweezers, atomic force microscopy, FRET pair analyses, etc.) to study the function and mechanism of isolated biological macromolecules (either in conjunction with or separate from ensemble assays in solution) are strongly encouraged in the relevant biological category.

Specific criteria apply in each subject category as outlined below:

Chemical Biology and Nucleic Acid Chemistry

NAR encourages submission of papers describing the engineering, synthesis, delivery and application of novel nucleic acids, nucleic acid binding proteins, or their derivatives. Examples of such studies might include:

  • Novel syntheses or modifications of nucleic acids or nucleic acid binding proteins that lead to a desired, beneficial effect in a biological application.
  • Novel methods of delivery of nucleic acids or nucleic acid binding proteins, that involve new mechanisms or that demonstrate significantly improved effectiveness, especially in whole organisms.
  • Cellular and in vivo targeting applications of nucleic acids or their derivatives (such as antisense, siRNA or aptamers) or nucleic acid binding proteins, where there is a strong emphasis on understanding their mechanism of action.
  • Design or selection of nucleic acids, or nucleic acid binding proteins, that leads to a novel ligand binding or catalytic activity, a unique regulatory function, or the ability to selectively modify gene function. Studies that reveal novel principles of biomolecular engineering are particularly encouraged.
  • Studies that facilitate (i) the creation of novel materials and devices via the manipulation of individual nucleic acid based oligomers and polymers (i.e. nanotechnology and nanomaterial development), (ii) genome engineering, and/or (iii) the creation of novel genetic and cellular circuits or systems.
  • Creation of new biological systems. Studies that reveal novel principles of rewriting and reconfiguring natural systems to understand the origins of life are also encouraged.

Chemical synthesis of novel nucleoside or nucleotide analogues will not be considered unless there is a significant and demonstrated useful application relating to oligonucleotide or nucleic acids structure or function. Papers that describe molecules that are primarily intended for use as in vitro sensors are more appropriate for the Methods category.

Experiments that include the use of synthetic oligonucleotides of any type must report both their exact sequences and exact chemical modifications at any position, as well as a source for acquisition of these reagents and/or precise methods for their creation. This information can be provided either in the main text or in supplementary information.

Knockdown experiments with duplex RNAs or antisense oligonucleotides should follow published guidelines.

Computerbiologie

Manuscripts may be considered if they fall into one of two categories:

  1. Description of a new algorithm that represents a substantial improvement over current methodology, and that has direct biological relevance. It should be bench-marked on gold-standard datasets and ideally, be supported by experimental validation where applicable. The performance of such algorithms must be compared with current methods and the relevant statistics (e.g., sensitivity, selectivity, etc.) of the performance must be indicated. Limitations of the method and general directions for future improvement should be reported. Incremental improvements or obvious modifications of existing algorithms will not be considered.
  2. Primarily describe the use of existing computational methods to generate significant, novel biological information and insight. Limitations of the approach and issues that may affect the conclusions drawn must be explicitly stated. Purely descriptive 'data mining' studies, (e.g., those that computationally predict biomarkers from disease expression datasets or those that simply compile or catalogue microRNAs from published datasets without providing significant biological or mechanistic insight) are discouraged.

In either case, the manuscript must be written so as to be understandable to biologists. It should ideally report insights pertaining directly to nucleic acids, or to cellular processes that involve nucleic acids. Extensive use of equations should be avoided in the main text and any detailed mathematics should be presented as supplementary material.

Availability of algorithms and code: If the manuscript describes new software tools or the implementation of novel algorithms the software must be freely available to users at the time of submission (either as executable versions for multiple, common platforms or as source code). Availability must be clearly stated in the article. Authors must ensure that the software is available for a full TWO YEARS following publication, preferably through a download link on a stable URL. Authors are strongly encouraged to make their source code available through an open source license (see OpenSource for examples).

Manuscripts that describe computational methods that primarily focus on protein multi-sequence alignment algorithms, prediction of protein folds or structures, or prediction of protein-protein binding sites or affinities will not be considered by NAR (with the possible exception of papers prepared specifically for the annual NAR special issues on Web Servers or Databases, as described above)

Manuscripts describing results from molecular dynamics simulations will be considered only if they provide valuable new insights into biological questions related to nucleic acids. Theoretical results must be put into perspective with available structural and/or biological data, although it is not always essential for them to be accompanied by experimentation. However, theoretical interpretations or speculative ideas should be experimentally testable and, if not backed up by experimental results, should constitute only a small part of the manuscript. Constraints or limitations of the simulation method or theoretical approach used should be identified and discussed. Manuscripts must be written so as to be intelligible to as wide an audience as possible and should avoid jargon and undefined terms.

Data Resources and Analyses

The Data Resource and Analyses category is designed to highlight papers documenting and interpreting substantive amounts of new biological data. To be considered for publication at NAR, these manuscripts should usually report a major informational database/dataset/data resource and provide new biological insights that can be derived from an analysis of the dataset(s). Significant examples of experimental and/or theoretical validation, in addition to the dataset itself, are expected to be included and described in sufficient detail to allow replication and further examination by interested investigators (e.g. trends that are consistent on a genomic scale with the reported findings).

Data Resources should be made available via web services or as standalone repositories to be downloaded for local use.

Data Resources should be compared to resources already available. Analyses and performance should be bench-marked against state-of-the-art methods and datasets already available. If a specific analysis is presented on a restricted range of examples as a proof of concept, it should be further validated on a larger scale, using the genome/transcriptome etc. data available.

Examples of such resources include (1) collections of whole genome sequencing, transcriptomic or epigenomic data accompanying changes in cell fate, (2) the output of substantive functional, genetic, biochemical or phenotypic screens, (3) sequence data corresponding to novel, comparative analyses of the genomes and/or transcriptomes of multiple organisms or experimental samples e.g. single cells, tissues, key model organisms, etc.) or (4) comprehensive, <i><u>clearly novel</u></i> meta-analyses of existing datasets. In the case of analyses of previously published datasets, the study should clearly state and support the new conceptual and/or biological insights arising from the analysis that are experimentally testable. Analysis and data resource of disease conditions might be considered but such studies should provide new mechanistic insights and the reported findings should be of interest and within the scope of the journal.

Manuscripts describing data resources and analyses that are specific to or derived from a single model system or organism should offer a substantive, unambiguous indication of its general interest and utility for a wide community of research investigators. Data resources that are limited to detailed studies of a narrowly employed organism are often more appropriate for a journal specifically focused on applications employing that model system.

Papers proposing biomarkers or collection of existing datasets will not be considered.

Gene regulation, Chromatin and Epigenetics

For consideration, papers should provide new insights into generally applicable principles or mechanisms that extend beyond a single gene, or present new information about the mechanisms underlying the regulation of genes involved in the synthesis, maturation, or degradation of nucleic acids. Findings must demonstrate relevance to the physiological or cellular context in which the process occurs.

The Journal specifically encourages manuscripts that:

  • Identify novel structural or dynamic features of chromatin.
  • Provide novel insights into the functions of elements or factors that mediate long-range interactions such as insulators and enhancers.
  • Present new mechanisms underlying the functions of promoters,, terminators, silencers, RNA polymerases, transcription factors and other DNA binding proteins.
  • Report significant new information about histone and DNA modifying enzymes and chromatin remodelling factors.
  • Provide novel insights into mechanisms through which covalent modification of DNA or chromatin proteins impinge on gene expression.
  • Probe the interfaces between transcription, chromatin and RNA processing (including post-transcriptional processing and regulation of transcribed RNAs).
  • Provide mechanistic insights into how large or small non-coding RNAs influence chromatin structure and function and/or gene regulation.
  • Use single cell approaches and mathematical modelling to reveal new gene regulatory mechanisms.

Papers that primarily report the application of genome-wide approaches to the analysis of gene expression or regulation should provide new biological or mechanistic insights with detailed follow-up investigation otherwise, they may be more appropriate for the Data Resources and Analyses category.

Genome Integrity, Repair and Replication

The Journal encourages manuscripts focusing on systems for maintenance of genome integrity. In particular we encourage manuscripts that:

  • Report novel mechanisms for sensing and responding to DNA damage.
  • Characterise the structural biology of DNA damage sensors and repair enzymes.
  • Use novel experimental approaches or models.

Manuscripts dealing with DNA replication should provide significant new information about proteins that act by directly contacting the template.
Papers may use physical, genetic, developmental, biochemical, or cell biological approaches.

Genomik

The Journal encourages the submission of manuscripts that:

  • Report the DNA sequences of complete genomes, large chromosomes or extensive gene families accompanied by bioinformatic analyses that shed significant new light on basic questions of structural or functional interest. Papers should include complementary experimental data with relevance to genomic organisation, transcription, RNA processing, expression, genetic inheritance or other novel biology. These data would typically correspond to molecular, biochemical or other equally informative analyses that support sequence-based functional annotation. Exceptions to this requirement might be made for analyses of entire genomes or large/dynamic gene families that display unusual features or provide especially novel or significant insights, including comparative studies. Reports that merely summarize information from DNA sequence database annotations, or that focus primarily on topics outside of NAR's core subject areas, are discouraged.
  • Report application of whole genomic approaches to the analysis of gene regulation (e.g. RNA sequencing/array and proteomic technologies, ChIP-Seq or computational methods). Such manuscripts must provide novel insights into a nucleic acid-based process and provide experimental evidence to validate hypotheses generated using genome-wide approaches. ChIP-seq studies should go beyond the analysis of a single factor associating with DNA/chromatin and basic downstream bioinformatic characterisation. Correlative studies or purely descriptive accounts of microarray or sequence data will not be considered. Extensive new sequence datasets or comparative (data mining) studies that do not include experimental validation of biological relevance are more suitable for the Data Resources and Analyses category.

Nucleic acid sequences must be deposited in a databank with a release date no later than the date of publication (see General Policies).

Molekularbiologie

The Journal encourages the submission of manuscripts that relate to physical, chemical, biochemical, or biological characteristics of nucleic acids. Examples of such papers include:

  • Novel studies of nucleic acid processing and packaging that report fundamental and general features that extend beyond individual cellular or viral systems
  • Characterization of nucleic acid folding or nucleic acid binding interactions, including studies that report the thermodynamic and/or kinetic basis for folding or binding events, where there is a clear and important question or hypothesis relevant to cellular processes
  • New insights into nucleic acid trafficking within and between cells, including nuclear or organellar transport, and/or nucleic acid intracellular modification
  • Novel aspects of molecular recognition between DNA and RNA sequences and small molecules where such studies have clear biological relevance. This may include sequence-dependent binding, base recognition and novel recognition motifs. Descriptions of in vitro aptamer selection experiments and resulting constructs will generally not be considered.

Nucleic Acid Enzymes

The Journal encourages manuscripts that report detailed mechanistic, structural and/or biological studies of enzymes that act upon nucleic acid substrates and targets, as well as naturally evolved or laboratory-generated constructs composed of nucleic acids that can themselves act as enzymes (i.e. ribozymes and DNAzymes). Systems of interest include, but are not limited to enzymes involved in DNA replication, RNA synthesis, DNA and RNA editing, translation, DNA fidelity and repair, transposition and recombination, DNA cleavage and restriction.

RNA and RNA-protein complexes

For consideration, papers should provide new insights into generally applicable principles that govern RNA metabolism or present new information about the mechanisms underlying the synthesis, maturation, or degradation of all classes of RNA in prokaryotes and eukaryotes. Findings must have implications that extend beyond a single transcript or RNA binding protein and include experimental evidence supporting biological and functional relevance such as mutational data.

The Journal specifically encourages manuscripts that:

  • Describe novel aspects of the biogenesis, cellular roles or mechanisms underlying regulation of or by non-coding RNAs including microRNAs, small interfering RNAs, piwi-associated RNAs and long non-coding RNAs.
  • Provide new insights into the molecular determinants of RNA half-lives, constitutive and regulated turnover mechanisms, and surveillance pathways that eliminate aberrant transcripts.
  • Shed new light on the mechanisms and regulation of constitutive or alternative processing of pre-messenger RNAs including splicing, polyadenylation and editing.
  • Report new insights into the structure, assembly, activity or regulation of ribosomes, snRNPs and other stable ribonucleoprotein particles.
  • Provide new information about the structure and dynamics of RNA enzymes (ribozymes) or RNAs that contribute to catalysis such as spliceosomal snRNAs.
  • Identify and elucidate the functional roles of novel RNA binding proteins or enzymes studies that provide new insight into proteins that “write” or “read” RNA modifications are especially encouraged.
  • Elucidate the mechanisms through which RNA modification are introduced, changed, or removed, describe mechanistic studies that reveal the role of modifications on the RNA folding, structure, and interactions, or describe novel methods for the detection and analysis of modifications in RNA sequences and structures. Studies that report the results of experimental analyses of RNA populations carrying a particular modification are also acceptable especially if they include follow-up experiments that provide mechanistic insight into the physiological or functional relevance of the modification.

Papers that primarily report the application of transcriptome analyses or other genome-wide approaches to the identification and classification of RNAs may be more appropriate for the Data Resources and Analyses category.

Knockdown experiments with duplex RNAs or antisense oligonucleotides should follow published guidelines.

Structural Biology

The Journal encourages manuscripts that report significant, biologically relevant structural features or principles as determined by X-ray crystallographic, NMR and/or Cryo-electron microscopy (CryoEM) studies. Reports on minor variants or closely related homologues of well-established structures are generally not suitable unless significant new insights are obtained. Manuscripts that utilise database and bioinformatics approaches must be firmly related to experimental observations. Papers that describe new biophysical and structural methods, but do not contain novel findings relating to an important biological problem, are more appropriate for the Methods category.

Submitted papers that describe the determination of new macromolecular structures (in this category or any other) must be accompanied by supplementary files for each structure (which will not be published but will be made available to editors and peer reviewers) corresponding to (i) final modeled coordinates, (ii) experimental data (in the case of CryoEM structures, the map file(s) used for model fitting) and (iii) PDB validation reports.

Synthetic Biology and Bioengineering

NAR encourages submission of papers describing the modification and/or redesign of genetic information in living cells and organisms, deliberate genetic recoding of biological pathways and decision points to alter biological behaviors and responses, or the generation of organisms harboring synthetic genetic circuits or dramatically altered or synthetic genomes. Examples of such studies might include:

  • The development and use of site-specific genome engineering.
  • The creation of novel genetic circuits or pathways in living cells.
  • The creation of new nanomaterials involving nucleic acids (e.g., DNA origami etc.), and nanomachines based on or acting on nucleic acids.
  • Use of an expanded DNA alphabet or an expanded genetic code (either through the expansion of the DNA alphabet to include unnatural base pairs or by the use of suppressor tRNA approaches) to create nucleic acid and protein modifications that result in unique biological activities and phenotypes in living cells and organisms.
  • The creation of new biological parts, systems and synthetic organisms. Studies that reveal novel principles of rewriting and rebuilding the natural systems to understand the origins of life are encouraged.

Newly designed or engineered constructs and genetic ‘parts' should be made publically available, most usually by registration and deposition of constructs and vectors in ADDGENE. Additional forms of standardization such as use of the BioBrick standard and its Registry of Standard Biological Parts, is encouraged when appropriate.

Please note that the main text of all submissions in this category, like all others, must be written in a manner that is easily understood by non-specialists and readers comprising a broad spectrum of molecular and cellular biologists. The main text in all submissions must be largely, if not entirely, free of specialized jargon and mathematical derivations that will only be understood by specialists working directly in the field of the submission. More detailed information required for specialists working in areas related to the manuscript's precise focus can be provided in the supplemental information.